[发明专利]由干细胞制备心肌细胞的方法和组合物及其用途

说明书

本发明涉及应用骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂如Noggin提高干细胞心肌分化效率的新组合物和方法。本发明还涉及分别通过刺激或不抑制维甲酸信号通路、或通过抑制干细胞内维甲酸信号通路而促进由干细胞形成心房及心室心肌细胞的新组合物和方法。本发明进一步涉及由所述干细胞形成的心房心肌细胞和心室心肌细胞，以及所述心肌细胞的应用，如用于心脏损伤修复以及筛选用于治疗心脏损伤的新疗法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年6月13日提交的、名称为“干细胞高效分化为心房和心室的心肌细胞的方法”的中国专利申请201010207603.0的优先权。上述中国专利申请的公开内容通过引用整体并入。

技术领域

本申请涉及用于提高干细胞的心肌分化效率以及促进干细胞形成心房肌细胞和心室肌细胞的新组合物和方法，以及所述干细胞分化的心房肌细胞、心室肌细胞本身及其应用，例如用于心脏损伤修复与筛选治疗心脏损伤的新疗法。

背景技术

利用现有的技术从人类胚胎干细胞(hESCs)分化心肌细胞只能获得非特异性分化的由胚胎心房样心肌、心室样心肌以及起搏细胞亚型组成的混合心肌细胞^6-9。猪移植研究表明，植入这样的由人类胚胎干细胞分化的混合心肌细胞具有起搏活性，这种活性使心肌细胞移植具有导致室性心律失常的潜在风险¹⁰。因此，hESCs分化得到的心肌细胞的这种心肌亚型异质性阻碍了hESCs在心肌修复中的应用¹。为引导hESCs分化为所需的心肌亚型，必须揭开心肌亚型特化的分子调控机制。尽管已确定多种生长因子如Activin A、骨形态发生蛋白4(BMP4)、wnt-3a、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及dickkopf同系物1(DKK1)可促进心脏发生并用于多种hESC心肌分化方案^7,8,11，至今仍没有证据表明这些或其它生长因子在hESC分化期间调节心肌亚型特化。确定心肌亚型特化的主要调节因素是降低hESC衍生心肌细胞群体异质性的关键，这对于其以后在再生医学中或作为药物测试系统的应用很重要^6,12。

中胚层和心脏发育期间，骨形态发生蛋白(BMP)信号被严密控制。在小鼠胚胎中，BMP拮抗剂头蛋白(Noggin)短暂但强表达于E7.5至E8.0日龄胚胎的新月形生心区¹³。Dkk1，一种心脏发育强效诱导物^8,1415，协同增强BMP拮抗剂在爪蟾胚胎的非心源性中胚层特化心脏组织¹⁶。已经表明，以BMP4长期处理hESCs将诱导滋养层样细胞分化¹⁷，而短期处理可起始中胚层形成¹⁸。综合来看，这些结果提示，中胚层形成后抑制BMP信号可以促进心脏的发育。

维甲酸(Retinoic acid,RA)信号制约着心脏祖细胞池，且在斑马鱼胚胎中可以利用RA的抑制剂BMS-89453将心区附近侧板中胚层的非心肌前体细胞诱导分化成心肌细胞¹⁹，同时RA还调节心脏的前后轴极化²⁰。鸡胚胎实验揭示在胚胎发育的4-6HH阶段心房前体组织经移植可以发育成心室，反之亦然^21,22。4HH阶段心原性组织的RA处理激活了心房特异性基因AMHC1在原定发育成为心脏流出道组织的前组细胞中表达²³。并且，在小鼠和鸡胚胎中，关键时期抑制RA信号引起发育具有过大心室和变小或缺失心房的胚胎，并且外源性加入RA导致胚胎心脏发育成过大的心房和过小或缺失的心室^5,24。此外，小鼠胚胎干细胞研究提示维甲酸促进心房相关基因的表达²⁵。

发明内容