[发明专利]同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测引物对、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测引物对，其特征在于：包括CYVCV检测引物对：CYVCV‐4f/CYVCV‐4r；CCDaV检测引物对：CCDV‐2f/CCDV‐2r；COX基因检测引物对：Ant1/Sen1；所述引物对的序列如下：

CYVCV‐4f：5’‐ATTACAGTGGTAGGGAGGAG‐3’，

CYVCV‐4r：5’‐CCCAGCAGGACGAGTTAG‐3’，

CCDV‐2f：5’‐ACAAGACTATCATAGCACGAGACG‐3’，

CCDV‐2r：5’‐TTTGAACTGTTTAAGTCCATCCC‐3’，

Ant1：5’‐CAATATCATTGATGTCCAATACT‐3’，

Sen1：5’‐ATTTATGTAATGGATTTAAGACCC‐3’。

2.一种同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测试剂盒，其特征在于：主要包括权利要求1中所述的引物对CYVCV‐4f/CYVCV‐4r、CCDV‐2f/CCDV‐2r和Ant1/Sen1，以及PCR反应试剂。

3.一种同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

(1)提取柑橘待测样品的总核酸；

(2)将提取到的总核酸进行多重PCR扩增；PCR扩增所用引物为权利要求1中所述引物对CYVCV‐4f/CYVCV‐‐4r，CCDV‐2f/CCDV‐2r和Ant1/Sen1；

(3)对步骤(2)所得扩增产物进行检测是否含有CYVCV、CCDaV和COX基因的扩增片段，从而判断样品是否感染CYVCV或CCDaV。

4.如权利要求3所述的同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR的反应体系为：10μM CYVCV引物CYVCV‐4f/4r各0.2μL，10μM CCDaV引物CCDaV‐2f/2r各0.5μL，10μM内参基因引物Ant1/Sen1各0.1μL，5μL 2×1step buffer，0.4μL PrimScript 1Step Enzyme Mix，1.0μL DEPC水。

5.如权利要求3或4所述的同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR反应条件为：50℃30min，94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，循环30次。

6.如权利要求5所述的同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中引物对CYVCV‐4f/CYVCV‐‐4r扩增产物片段大小为1314bp，引物对CCDV‐2f/CCDV‐2r扩增产物片段大小为916bp，引物对Ant1/Sen1扩增产物片段大小为372bp。

7.如权利要求5所述的同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中对扩增产物进行检测的方法为：将扩增产物进行1.0‐1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察是否出现1314bp、916bp和372bp的条带，如果同时出现1314bp和372bp的条带，说明样品感染了CYVCV；如果同时出现916bp和372bp的条带，说明样品感染了CCDaV；如果同时出现1314bp、916bp和372bp三条条带，说明样品同时感染了CYVCV和CCDaV。

8.一种如权利要求1所述的同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测引物对在柑橘黄脉病和柑橘褪绿矮化病检测中的应用。

9.一种如权利要求2所述的同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测试剂盒在柑橘黄脉病和柑橘褪绿矮化病检测中的应用。