[发明专利]一种普利卡那肽的制备方法

权利要求书

1.一种普利卡那肽的制备方法，包括以下步骤:

1）按普利卡那肽的序列，在Fmoc-Leu-树脂载体上由碳端向氮端逐一偶联Cys、Gly、Thr、Cys、Ala、Val、Asn、Val、Cys、Leu、Glu、Cys、Glu、Asp、Asn，制备得到线性普利卡那肽的肽树脂，其中，Cys侧链保护基分别是StBu、Mmt和Acm，Thr、Glu、Asp、Asn侧链保护基分别是tBu、OtBu、OtBu和Trt；

2）肽树脂在巯基乙醇的DMF溶液中反应，洗涤，然后加入过量的2,2’-二硫双（5-硝基吡啶）的DCM溶液反应，洗涤后加入TFA的含TIS的DCM溶液反应，进行第一次环化；

3）经过一次环化的肽树脂在I₂溶液中脱除7位、15位的Acm保护基，第二次环化；

4）肽树脂采用切割试剂将普利卡那肽从树脂上分离，得到粗肽，经过分离纯化获得普利卡那肽纯品；

所述线性普利卡那肽的肽树脂在树脂上直接成环，环化方法为：肽树脂在体积百分数10-50%巯基乙醇的DMF溶液中反应1-10h；然后加入5-20倍量DTNP的DCM溶液1h；洗涤后加入体积百分数0.5-5%TFA的含体积百分数1-10%TIS的DCM溶液反应20min，进行一次环化；树脂经过洗涤后，加入5-100倍当量I₂的DMF溶液反应0.5-5h，进行二次环化。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的巯基乙醇的含量为15-30%。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的肽树脂在巯基乙醇的DMF溶液中的反应时间为2-4h。

4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的一次环化反应采用的是体积百分数1%TFA的含体积百分数TIS 5%的DCM溶液。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的I2的DMF溶液的加入量为10-20倍当量。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的二次环化反应时间为1-2h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Leu-树脂载体的取代度为0.1 mmol/g-1.6 mmol/g。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Leu-树脂载体的取代度为0.2 mmol/g-0.6 mmol/g。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Leu-树脂为市售的羟甲苯基树脂与Fmoc-Leu-OH的反应产物。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Cys侧链保护基分别是4位StBu、12位的Mmt和7位、15位的Acm。

11.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，在步骤4）中，向含侧链保护基团的普利卡那肽树脂中加入体积比为95/2/2/1的TFA/TIS/EDT/H₂O，或体积比为90/5/3/2的TFA/thioanisole/anisole/EDT，或体积比为82.5/5/5/5/2.5的TFA/thioanisole/H₂O/phenol/EDT的裂解试剂，冰浴反应0.1-1h后，室温下继续搅拌反应1-10h，然后抽滤；抽滤后将裂解试剂滤液利用旋转蒸发和/或N₂气吹至无TFA溢出，加入沉淀试剂静置；离心分离沉淀的普利卡那肽粗肽，其中所述沉淀试剂包括:乙醚、环己烷、甲基叔丁基醚、石油醚、体积比为1:10-10:1的乙醚/石油醚、体积比为1:10-10:1的乙醚/环己烷。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述裂解试剂是体积比为95/2/2/1的TFA/TIS/EDT/H₂O，所述沉淀试剂为乙醚。

13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用HPLC方法分离得到普利卡那肽纯品。