[发明专利]一种以CYP2E1为靶点的药物筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种以CYP2E1为靶点的药物筛选方法。

背景技术

细胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP450)是一类能够与重金属结合的配体，形成的酶在生物细胞通过可逆性的变化而进行电子传递。CYP450于1995年从哺乳动物肝脏的微粒体中发现的，随后在包括昆虫、细菌到高等动物均有发现。CYP450参与催化许多生物过程并引起了专家和学者的广泛关注。

CYP2E1在许多疾病和生理病理状态下发挥重要作用，并且能够影响致癌作用和药物的疗效。CYP2E1能够催化外源性物质的生物转化，包括药物及毒性物质，如对乙酰氨基酚，挥发性麻醉药(安氟醚，异氟烷，三氟溴氯乙烷)，乙醇以及工业溶剂和化学物质(前致癌物质)。另外，CYP2E1也参与内源性物质的生物转化，如酮体，甘油和不同的脂肪酸。然而，CYP2E1同样能够代谢药物和有毒物质产生有害的活性代谢产物。例如，CYP2E1将对乙酰氨基酚代谢为N-乙酰基对苯醌亚胺，从而诱导氧化应激，线粒体功能丧失和细胞死亡。不仅如此，CYP2E1产生活性氧(ROS)，可以破坏细胞和线粒体，包括线粒体DNA和细胞色素C氧化酶在内的组分。CYP2E1的重要特征之一是可以被不同的小分子有机化合物所诱导，如酒精，吡唑，丙酮或异烟肼等。事实上，酒精诱导CYP2E1是通过抑制其自身降解增强CYP2E1蛋白稳定性及激活CYP2E1转录基因增加其蛋白浓度。因此，在酒精中毒时，肝脏中CYP2E1的含量会显著升高。

目前研究认为，在不同的生理病理状态下均能够提高CYP2E1的mRNA或蛋白的表达，包括肥胖，禁食，II型糖尿病和非酒精性脂肪肝等疾病。通过提高CYP2E1的表达从而导致肥胖，糖尿病或非酒精性脂肪肝病的机制目前仍有争议。在这些病人中，CYP2E1的诱导能够导致肝脏的生酮作用。近期报道称，肝CYP2E1的诱导可以证实与系统性胰岛素抵抗，肝胰岛素信号消减和肝脂肪堆积提高紧密相关。除升高的酮体和胰岛素抵抗，其他因素如肝中脂肪过量堆积或脂肪因子(脂联素，瘦素，等)的分泌也可能是引起肥胖患者CYP2E1表达/活性升高的重要原因。CYP2E1在健康人群和肥胖/糖尿病人中均可产生ROS和活性代谢产物，从而使机体对药物和有毒物质更加敏感。因为线粒体内CYP2E1可以代谢产生大量的有毒物质，从而导致线粒体损伤和功能障碍，最终诱导细胞凋亡产生肝硬化和细胞凋亡。因此，CYP2E1在疾病的发生和药物代谢中发挥重要作用。

目前，针对CYP2E1的药物筛选局限于其抑制剂的筛选。提取肝脏微粒体，将药物加入到含底物(4-硝基苯酚)，NADPH生成系统，6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶的磷酸钾缓冲液中，检测CYP2E1的活性，从而筛选出CYP2E1的抑制剂。但此方法存在局限性：1)肝脏微粒体的提取条件要求苛刻：需要超高速低温离心机；2)提取的微粒体蛋白含量少且易失活：超高速离心得到微粒体蛋白会紧密的形成一团，在微粒体蛋白吹打溶解的过程中容易产生气泡从而氧化失活；3)对CYP2E1诱导剂的筛选无效：微粒体蛋白提取后质量不会增加，诱导剂不能增加CYP2E1的总量；4)药物干扰：检测CYP2E1活性是采用分光光度法在A535nm处检测1mg蛋白在15min内CYP2E1代谢产物(4-硝基儿茶酚)的生成含量计算，某些药物在A535nm也有吸收峰会对CYP2E1活性的检测形成干扰。

鉴于微粒体以上不足，线粒体成为本方法的靶器官。CYP2E1定位于线粒体的证据，于1997年，Avadhani课题组用抗体蛋白直接识别线粒体内CYP2E1第一次发现CYP2E1在线粒体内的存在，随后电镜实验证明免疫胶体金标记CYP2E1同样存在于线粒体内膜上。随后，从大鼠肝线粒体纯化出线粒体蛋白，鉴定全长的CYP2E1，并研究其分子性质和酶活性。酒精和吡唑是CYP2E1的诱导剂，在吡唑处理的大鼠的肝脏中，线粒体CYP2E1占肝组织总CYP2E1的40％，并且线粒体中CYP2E1的磷酸化高于内质网线粒体。AMLDI-TOF分析法和氨基端氨基酸测序法证明大鼠肝线粒体CYP2E1与微粒体CYP2E1有共同的氨基酸序列。线粒体和微粒体内CYP2E1的结构大部分是相同的，无明显差异。在人和大鼠的脑线粒体中也发现CYP2E1的存在。有趣的是，CYP2E1依赖的单氧化酶N-nitrosodim-ethylamine-N-demethylase在脑线粒体中的活性是微粒体中活性的两倍。因此，与微粒体CYP2E1相比，线粒体CYP2E1结构无差异，但活性CYP2E1的含量却明显高于内质网含量。