[发明专利]一种小麦基因组DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物基因组DNA提取方法，具体涉及一种小麦基因组DNA提取方法。

背景技术

随着分子生物学不断的发展，众多分子生物学实验的样本需求量都很大，简便快捷高效稳定的DNA提取技术是从分子水平上推进小麦相关研究发展的必要前提，也是研究效率的关键。小麦基因组的DNA提取一般须经过破碎细胞壁、裂解细胞膜、除去多糖和多酚等次生物质、变性分离蛋白质、沉淀核酸、去除RNA和浓缩DNA等几个步骤。一般来说，CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法对处理含多糖成分的植物组织有独特的优势，广泛应用于植物基因组DNA的提取，而SDS(十二烷基硫酸钠)法在植物基因组DNA的提取中应用较少，主要应用于对模板DNA质量要求不太严的RAPD分析。但传统的CTAB法操作繁琐，试剂消耗量大，并且使用器皿多，研磨器皿等需要重复利用，易造成样品污染，产率也较低。

目前，关于植物DNA提取方法的报道绝大部分都是在SDS法和CTAB法基础上进行改良，但都无法摆脱用研磨棒或玻璃棒对样品逐个研磨的操作步骤，且提取步骤繁琐耗时。近年来也出现了植物DNA其他的简易提取方法，如高盐低pH值法、碱处理法、高温水煮法等，虽然这些方法步骤简单、速度快、成本低，避免使用液氮、苯酚等试剂，但是往往存在着DNA提取质量较差、一天能够提取300份样品左右，不能满足要求较高的PCR扩增等诸多问题。因此，迫切需要建立一个快速经济高通量高质量的DNA提取方法，为PCR扩增、分子标记辅助育种、基因定位和转基因植物检测等多种分子实验提供有效手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种简便、快速、高通量、高质量的小麦基因组DNA提取方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种小麦基因组DNA提取方法，将待提取小麦材料样品分别置于96孔板中，接着在每孔中放入钢珠，开盖置于真空冷冻干燥器中在-100～-120℃冷冻干燥20～28h，然后利用研磨仪对小麦材料样品进行研磨；最后采用改良的SDS法利用排枪从研磨后的粉末中提取DNA。

进一步，所述小麦材料为小麦种子播种发芽，第一片真叶展开后的新鲜真叶；所述每孔待提取小麦材料样品的用量为50～100mg。

进一步，所述新鲜真叶的长度为4～6cm。

进一步，所述96孔板为96孔联体试管板，使用96孔联体试管板，而不是单个离心试管，对叶片进行冷冻干燥后粉碎，无需使用液氮。

进一步，每孔放入1个无水酒精清洗的钢珠，每个小试管中放入一个钢珠保证各个样品单独研磨避免了其他方法研磨时出现研磨器具重复使用造成交叉污染的可能性。

进一步，所述采用改良的SDS法利用排枪从研磨后的粉末中提取DNA的方法，包括以下步骤：

(1)将研磨后的粉末样品在2～6℃，4000rpm，离心10min后，利用排枪向管中加入SDS提取液，匀质化后，加入等体积酚、氯仿和异戊醇的混合液摇匀，其中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1，在-20℃冰箱冷冻10min后，接着在4℃环境中静置10min；

(2)取出样品称量配平，在2～6℃，4000rpm，离心20～25min，利用排枪自上往下缓慢吸取上清液于96孔板中，并在96孔板中加入与上清液体积比为1∶10的NaAc和1∶1的-20℃预冷的异丙醇，盖上96孔盖子混匀，放入-20℃冰柜冷冻30～50min，直至DNA沉析出；

(3)将冷冻过的样品取出称量配平在2～6℃，4000rpm，离心10min后，打开96孔盖子，迅速翻转96孔板倾倒管中的全部液体，将96孔板倒置在干燥的吸水纸上吸湿2～3次，将96孔板翻转朝上，加入与上清液等体积的75％的酒精洗涤沉淀一次，在2～6℃，4000rpm，离心5min，迅速倾倒全部清洗液，将96孔板倒置在干燥的吸水纸上吸湿2～3次，将96孔板翻转朝上，加入与上清液等体积的无水乙醇洗涤沉淀一次，在2～6℃，4000rpm，离心5min，迅速倾倒全部清洗液，将96孔板倒置在干燥的吸水纸上吸湿2～3次，将96孔板翻转朝上，在超净工作台内干燥2～3h，加入与上清液等体积的TE或ddH₂O。