[发明专利]一种测定转录调控复合体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定转录调控复合体的方法，具体涉及一种在同一实验体系中同时测定转录调控复合体的方法。

背景技术

细胞是由不同生物分子间相互作用形成的一个有序的生命活动基本单元，细胞内重大生命活动的发生和调节是通过分子间相互作用完成的。随着后基因组时代的到来，以生命内组元件间动态相互关系为研究对象的相互作用组学成为当今系统生物学研究的热点之一。然而简单的两两相互作用研究并不符合生命的动态特征，应从整体角度系统地研究相互作用组网络，因此，深入研究各分子间相互作用，特别是利用高通量的研究方法构建相互作用组网络，不仅可以全面地认识生命体的生理功能，系统理解分子调控机理，发现分子间互相联系的内在规律，还可能发现许多未知蛋白质的功能线索，对于从网络层面上整体认识疾病发生机制，对于揭示生命活动奥秘有重要意义。

目前，研究蛋白质相互作用的方法主要有体内和体外两类检测方法，体内检测手段主要包括酵母双杂交技术、细菌双杂交技术，荧光共振能量转移，蛋白质片段互补等，体外检测方法主要有免疫共沉淀-质谱分析技术，蛋白质芯片，表面等离子共振，pull-down，噬菌体展示技术等；同样地，研究蛋白质核酸相互作用的方法也主要分为体内和体外两大类，体内方法主要有酵母单杂交，染色质免疫沉淀等，体外方法有SELEX核酸适配体技术，凝胶阻滞实验，DNase I足迹等。体内技术均是在活细胞水平检测蛋白质之间的互作以及核酸与蛋白质之间的互作，这些技术是基因水平的操作，无需蛋白质纯化分离步骤，操作相对简单，另外在体内蛋白质容易正确折叠，提高了检测灵敏度，可检测到蛋白质之间以及蛋白质-核酸之间微弱或者瞬时的相互作用。体外技术是在离体条件下进行互作的检测，靶分子范围广，库容量大，便于大规模平行检测。

近年来，核酸高通量测序技术飞速发展，如果可以将蛋白质测序技术转化为核酸测序技术，这将为高通量平行测定相互作用提供可能性。cDNA展示技术将基因型(核酸序列)与表现型(氨基酸序列)共价连接，实现了蛋白质序列测定与核酸序列测定的转换，因此我们可以基于该技术建立一种新的测定相互作用的方法。

cDNA展示技术(cDNA display)是Nemoto等于2009年在mRNA展示技术(mRNA display)基础上发展和完善起来的一种稳定性更强、更实用的体外定向进化技术。1997年，Yanagawa和Szostak先后独立提出mRNA展示技术。该技术通过嘌呤霉素连接子将mRNA与其翻译的蛋白质共价连接在一起，形成稳定的mRNA-肽融合体，可得到库容量在10¹²-10¹⁴的随机肽库。mRNA展示技术的高通量性以及其他特性为研究互作提供了很好的平台。Shen等人构建了人不同组织的蛋白质文库来筛选钙离子依赖-钙调蛋白的互作蛋白。通过两轮的循环，共获得269个已有注释或者预测的互作蛋白。2008年，他们又在秀丽线虫蛋白文库中做了类似的实验，获得9个已知的钙调蛋白的互作蛋白，47个未知的互作的蛋白。Miyamoto-Sato等人通过麦胚提取液表达系统共翻译诱饵蛋白Fos及不同组织的蛋白文库来研究其的互作蛋白，共富集到10种直接或者间接与Fos互作的蛋白质。Tateyama等采用串联的TPA响应元件作为诱饵DNA序列，在由小鼠脑组织cDNA构建的随机蛋白库中，进行了六轮筛选，获得了AP-1家族一系列转录因子，其中有c-jun，c-fos，junD，junB，atf2以及b-atf等，该结果表明采用mRNA展示技术可以进行核酸蛋白质相互作用的筛选，并且便于进行蛋白质复合物的筛选。

cDNA展示技术对mRNA展示技术进行了重要改进，设计了一种新型的嘌呤霉素连接子，从而可以快速有效地形成cDNA-肽融合体，进行后续的体外选择实验。同时，DNA的稳定性远好于RNA，因此cDNA展示技术可以在更苛刻的环境下(如高温、高pH)进行实验，非常适合检测各种相互作用。另一方面，cDNA展示技术在定向进化的受体选择方面已经有了初步应用，Naimuddin等将一种α-蛇神经毒素的受体结合部位残基进行了随机突变，构建突变文库后，与受体进行亲和性分析，发现大部分都具有特异性亲和，IC₅₀在纳摩级别范围。鉴于cDNA展示技术的各种优点，以及mRNA展示技术在PPI中的成功应用，我们认为cDNA展示技术是研究相互作用的合适的技术。