[发明专利]一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法

权利要求书

1.一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)载体酶切线性化与目的DNA片段PCR扩增：载体使用限制性内切酶进行酶切线性化，产生平末端，并回收线性化质粒DNA；目的DNA片段使用DNA聚合酶进行PCR扩增并回收PCR产物；

(2)载体与PCR产物连接：将平末端线性化载体与平末端PCR产物混合，然后加入限制性内切酶与T4DNA连接酶同时存在的反应体系中，设定连接温度进行连接反应，线性化载体既可以与目标PCR产物片段发生连接，产生目的重组子，也可以发生载体自连，当载体与PCR产物连接成为重组子时，反应体系中的限制性内切酶无法将连接点切开；当发生载体自连时，设定酶切温度进行酶切反应，限制性内切酶将自连载体切为平末端载体，继续与游离的PCR产物发生连接；该反应过程为连接反应和酶切反应的交替循环，最终反应终止于酶切反应。

(3)将上述体系直接转化入感受态大肠杆菌，涂平板培养，转化子即为阳性克隆。

2.根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法，其特征在于：所述限制性内切酶为可产生平末端的限制性内切酶，可以是SmaI和FspI等。

3.根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法，其特征在于：所述步骤(1)中DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶。

4.根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法，其特征在于：所述步骤(2)中平末端线性化载体与平末端PCR产物的混合摩尔比范围为1∶3-1∶100。

5.根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法，其特征在于：所述步骤(2)中连接温度为20-25℃。

6.根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法，其特征在于：所述步骤(2)中酶切温度为20-40℃。

7.根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法，其特征在于：所述步骤(2)中连接反应的反应时间为20-40min。

8.根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法，其特征在于：所述步骤(2)中酶切反应的反应时间为20-40min。

9.根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法，其特征在于：所述步骤(2)反应时间为10-14h。

10.根据权利要求1所述的一种利用平端连接法高效筛选阳性转化子的DNA重组方法，其特征在于：所述步骤(3)反应时间为10-14h。