[发明专利]一种同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法

权利要求书

1.一种同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法，四种病毒为水稻瘤矮病毒（RGDV），水稻齿叶矮缩病毒（RRSV），南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）和水稻黑条矮缩病毒（RBSDV ），其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，扩增引物的设计；

步骤二，样品总RNA的提取；

步骤三，单重RT-PCR检测；

步骤四，四重RT-PCR优化；

步骤五，四重RT-PCR的灵敏度分析；

其中，步骤一中先下载病毒基因组序列，然后对下载的序列进行同源比对，以RGDV S8、 RRSV S8、RBSDV S6 和SRBSDV S10为模板，设计特异引物，利用BLAST在线软件检测特异引物，四种病毒的引物具体如下：

水稻瘤矮病毒的引物为：

上游引物：5’-GTACTCAGACCTGAACGTAGT-3’

下游引物：5’-CTCAATAGCGATCGCATACC-3’

水稻齿叶矮缩病毒的引物为：

上游引物：5’-CGCCGTATCTAACGTTCCAG-3'

下游引物：5'-TGCCGCGACATAATCAAC-3’

南方水稻黑条矮缩病毒的引物为：

上游引物：5’ –CGCGTCATCTCAAACTACAG-3’

下游引物：5’-TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-3’

水稻黑条矮缩病毒的引物为：

上游引物：5’-AATGCCACTTGCCAGTTACG-3’

下游引物：5’-GCTACTTCGTCAGTTAGATC-3’。

2.根据权利要求1所述的同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法，其特征在于，步骤二中的具体步骤如下：

（1） 分别剪取病害症状明显的水稻叶片约0.2g，液氮研磨后加入800μl Trizol和400μl的氯仿：异戊醇后转入2.0ml离心管涡旋混匀，其中，氯仿：异戊醇=24:1；

（2）4℃下12000rpm离心15min，取上清液于新的1.5ml离心管中加入等体积的预冷的异丙醇，轻轻混匀后置于-20℃下20min；

（3）然后4℃下12000rpm离心10min，弃上清；

（4）加入75%的预冷的乙醇，4℃下7500rpm离心5min，室温晾干沉淀后加入100ul无RNase的水溶解，-20℃保存备用或继续下游实验。

3.根据权利要求1所述的同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法，其特征在于，步骤三中的单重RT-PCR检测包括以下步骤：

（1）一步法RT-PCR扩增： PCR反应体系为：20ul反应体系中，2×1 step buffer 10.0ul，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 0.5ul，RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV各1ul上下游引物混合物和1.0ul RNA模板，最后补水至20ul；

PCR反应参数为：50℃反转录30min，94℃预变性2min；然后94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；最后在72℃延伸10min，降温至10℃结束反应；

（2）PCR产物电泳检测：取6ul PCR产物与1ul 6×loading buffer相混合，室温下进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为电压100V，时间40min，电泳结束后于凝胶成像系统观察电泳结果；

（3）电泳结果分析：分别得到RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV的扩增条带，依次约为244bp、397bp、682bp和1000bp，其大小与理论值相符。