[发明专利]一种铁皮石斛组培快繁的方法

说明书

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体地，涉及铁皮石斛组培快繁的方法。

背景技术

铁皮石斛，为兰科多年生附生草本植物。生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。一般均能耐－5℃的低温。石斛可分为黄草、金钗、马鞭等数十种，铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛具有独特的药用价值，以其茎入药，属补益药中的补阴药。野生铁皮石斛的自然繁殖能力低、生长缓慢，对生长的环境条件要求苛刻。在引种栽培时较难成活，给种质保存与利用带来较大的困难。因此找出一种种质资源保护的有效新途径，对铁皮石斛资源的修复和再生，防止流失、退化和灭绝，保障资源的可持续利用具有重要意义。

组织培养的关键技术是培养基及其培养条件，同一属不同种的植物其培养条件也不尽相同，不同的外植体其培养条件也不相同，因此对其外植体的选择及培养条件的选择具有十分重要的意义。

尽管铁皮石斛的组织培养获得了较大的成功，利用组织培养技术进行铁皮石斛种苗的快速繁育已没有很大的技术问题， 但市场需要往往与生产情况不一致， 如何使生产适合市场， 是组培技术成功运用于生产、并取得较高经济效益的关键。

目前对于铁皮石斛的组培快繁的研究比较多，但大部分采用的外植体是种子、花瓣、茎尖或带腋芽的幼茎，也有采用成熟的种胚的研究，对于利用花药作为外植体进行培养的研究还未见报道。

发明内容

针对现状，本发明提供一种铁皮石斛组培快繁方法，采用花药作为外植体，可以有效的克服后代易变异的问题，可以长期保持其优良的性状，并且出愈率高。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种铁皮石斛组培快繁的方法，包括如下步骤：

（1）外植体的选择与消毒：用70%浓度的酒精将手擦洗两遍，然后取单核靠边期的花药进行消毒处理，将花药用无菌纱布包裹浸入70％浓度的酒精中消毒10~20s，再浸入10%漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗1~3次；

（2）接种培养：将经过处理的花粉接种到接种培养基上，培养获得愈伤组织或直接分化出丛生芽；所述的接种培养基为：MS＋6-BA 0.1~0.4mg/L＋NAA 1~3mg/L+水解酪蛋白 0. 4～0. 8g/L，添加4%蔗糖和1%琼脂；培养基的PH为6.0，培养温度为25±1℃，12h/d的光周期，光照强度1600Lx；

（3）继代分化培养：将未污染的愈伤组织或丛生芽转入第一继代培养基中使芽增殖，继代3次，转入第二继代分化培养基或不添加任何激素的空白培养基中继代一次，然后再转入第一继代分化培养基中继续增殖，根据需苗量重复上述步骤；所述的继代分化培养基为：MS+6-BA0.5~1.0mg/L+ ZT0.1~0.5mg/L，添加5%蔗糖和1%琼脂，培养基的pH值为6，培养温度为24~28℃，光照强度1400~2000lx，光照时间为12~14小时/天；

（4）生根培养：经25~35天，丛生芽长至2~3cm，转入生根培养基培养1个月后，长成具根和4~6片叶的试管苗；所述的生根培养基为：MS+NAA0.1~0.4mg/L+IAA0.1~0.3mg/L，添加4%蔗糖和0.5%琼脂；所述培养基的pH值为6，温度为22~25°C，光照强度2600~2800lx，光照时间为12~14小时/天。

上述培养过程是在锥形瓶中进行，为了解决锥形瓶消毒不彻底的问题，本发明首先将其加入中药消毒液消毒10-30分钟，再将其放入高压蒸汽灭菌锅中进行消毒处理10~20分钟，这样对于一些难以去除的真菌微生物等，杀菌更加彻底，并且无残留和毒副作用，此方法也适用于其他植物的组培快繁所用器皿的消毒。

所述中药消毒液由以下重量比的物质组成：苦参 7～10份、野菊花3～5份、鱼腥草3～5份、大黄5～10份、甘草5～10份、黄柏6~8份；将上述药材粉碎，混合后投入沸蒸馏水中进行浸泡20~30min，然后加入3～5倍体积的纯净水， 煮沸后持续煮30～50 分钟，后过滤，沉淀1～2小时后取澄清液即可。

为了证明本发明的有效性，本发明进行了一系列的实验，具体如下：

（一）外植体的选择