[发明专利]一种提高重组蛋白包涵体形成的方法

说明书

本发明公开了一种促进重组蛋白在基因表达时形成包涵体的方法。此方法特征在于，在不提高诱导物浓度的前提下，低强度短时间的超声处理加速诱导物渗透至细胞内，使重组蛋白高表达时更容易形成包涵体。不仅可以通过降低诱导物的使用量来降低对宿主细胞的毒害作用，还适用于在较低的诱导温度下才能表达重组蛋白的工程菌。此方法操作简便，成本低。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，更具体地说，本发明涉及一种促进重组蛋白在基因表达时形成包涵体的方法。

背景技术

大肠杆菌的遗传背景清楚，目的基因表达水平高，表达系统成熟完善，易于培养（培养方法简单、生长快、培养周期短和抗污染能力强）和成本低，已经发展为一种有效基因工程体系。目前，大量的异源蛋白特别是真核生物的基因在大肠杆菌得到了高效表达，但由于宿主菌缺乏此种异源基因相应的表达调控机制，以及细胞内的化学环境与其天然环境差异（如氧化还原环境、胞内pH、自由水的浓度等），表达产物缺少饭以后的修饰（如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等），同时高表达时易折叠错误，导致表达产物多数以无活性的包涵体的形式存在。

除了基因的表达宿主菌和表达的环境外，包涵体在一些外界压力下也可以形成，如温度，是影响包涵体形成的主要因素。有些蛋白质在高温的情况下容易形成包涵体，这是由于这些蛋白质在高温下容易变性而形成聚集体。

包涵体是微生物细胞中密度最大的结构（密度在1.1~1.3之间），对机械搅拌和超声破碎作用不敏感。以包涵体形式表达的蛋白质在下游生产过程中具有一些优越性。表现在：

（1）以包涵体形式表达重组蛋白质，包埋了蛋白酶水解的作用位点，可以最大限度地降低异源表达的蛋白质被宿主细胞内的蛋白质酶降解；

（2）包涵体蛋白通常不具有活性，对机械搅拌和超声破碎作用不敏感，细胞破碎和以后的纯化步骤不用考虑蛋白质高级结构变化引起的失活问题；

（3）使用简单的离心或者过滤方法就能使以包涵体形式表达的外源蛋白与宿主细胞的其他蛋白成分进行有效的分离，与可溶性形式表达的重组蛋白相比，分离工艺简便和成本低；

（4）以包涵体形式表达的蛋白质通常也不具有生物活性，降低了异源蛋白对宿主细胞的毒性和致死效应，从而可以高效大量地表达和积累。

包涵体的形成的对结构蛋白质结构正确折叠是不利的，但是对于一些对蛋白质空间结构要求不严格的重组蛋白的表达是非常有利的，如复性容易的重组蛋白和一些后续需要化学试剂或蛋白酶处理的蛋白。

工程菌所表达的异源蛋白分为可溶性部分和不溶性的包涵体部分，促进异源蛋白以不溶性的包涵体形式表达的因素，除与异源蛋白质本身的性质和所用的宿主菌相关外，还跟表达的调控条件，表达的温度有关。一般表达速度越快，表达量越高越容易形成包涵体。常用以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）作为基因表达诱导物的pET系列载体，采取提高IPTG浓度或者提高表达温度的方法加速基因的高表达以促进包涵体的形成。前者由于IPTG对宿主细胞有毒性能增加的浓度有限，而后者在有些重组蛋白在温度提高时更易受到宿主菌蛋白酶的降解，使重组蛋白难以得到积累，造成表达量少甚至不表达的情况。因此这两种方法在很多重组蛋白包涵体表达上应用受到了限制。

发明内容

为克服已有技术存在的问题，本发明的目的提供一种工艺简单，所需要的溶剂少，成本低，用于促进重组蛋白包涵体形成的方法。

本发明提供的促进重组蛋白包涵体形成的方法，按照下述步骤进行：

（1）菌种活化：取超低温保藏的重组大肠杆菌，划线接种于固体培养基（胰蛋白胨16 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂15 g/L，卡那霉素50 μg/mL，pH 7.0）上，37℃培养12~16小时。