[发明专利]一种使用两种菌株藕合发酵实现丁二酸高产的方法

权利要求书

1.一种使用两种菌株藕合发酵实现丁二酸高产的方法，其特征在于利用产丁二酸的基因工程菌CCTCC NO：M2012041和筛选自野生菌的放线杆菌CGMCC 1593两个发酵系统藕合代谢，提高纤维素水解糖中葡萄糖和戊糖的利用率，同时兼顾了两种菌各自的优势。

2.根据权利要求1所述的使用两种菌株藕合发酵实现丁二酸高产的方法，其特征在于步骤为：

（1）纤维素水解糖的制备

根据传统的制备纤维素水解液的方法制备葡萄糖和戊糖混合物，本发明中以甘蔗渣作为纤维素原料，其组成控制为纤维素及半纤维素含量为18%，木质素含量为12%，水分含量70%，产自广西；

纤维素水解液制备后，其中葡萄糖及戊糖在总糖含量中的比例分别控制为70%及30%；

（2）基因工程菌CCTCC NO：M 2012041发酵系统的发酵

LB 培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，用去离子水配制；

感受态培养基：甘氨酸 30 g/L，Tween-80 1 g/L，用去离子水配制；

活化培养基LBHIS：酵母粉 2.5 g/L，蛋白胨 5 g/L，NaCl 5 g/L，脑心浸液 18.5 g/L，山梨醇 91 g/L，用去离子水配制；

种子培养基：在 LB 培养基中添加 5 g/L 葡萄糖；

菌体培养基：葡萄糖 25 g/L，K₂HPO₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.6 g/L，FeSO₄ 5 mg/L，硫胺素 0.2 mg/L，尿素 2.5 g/L，玉米浆 10 g/L，生物素 0.2 mg/L，用去离子水配制；

转化培养基：K₂HPO₄ 0.5 g/L，KH₂PO₄ 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，FeSO₄ 6 mg/L，MnSO₄ 4.2 mg/L，生物素 0.2 mg/L，硫胺素 0.2 mg/L，用去离子水配制；

种子于种子培养基中30℃、200 r/min下耗氧培养 24 h；然后以 5% V/V 的接种量接于菌体培养基中，30℃、200 r/min 下耗氧培养16 h；培养好的菌体在4000r/min下离心富集，以干重20 g/L的菌体浓度悬浮于转化培养基中，30℃、200 r/min下恒温振荡5h；

恒温振荡5h后的转化培养基在4000r/min的条件下离心后，富集下层菌体，并以干重20 g/L的菌体浓度加到纤维素水解液中，纤维素水解液总糖100g/L，葡萄糖控制为70g/L，戊糖控制为30g/L，转化40h后，丁二酸含量66.5g/L；

（3）放线杆菌CGMCC 1593发酵系统的发酵

第二种子培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 1.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，酵母膏5g/L，用去离子水配制；

    发酵培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆10g/L，葡萄糖25g/L，磷酸二氢钾 2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，酵母膏5g/L，乙酸钠1~5g/L，用去离子水配制；

    种子一级为TSB培养液，培养14h后接于第二种子培养基中，接种量4%，种子培养达到7h后，将培养液接入厌氧发酵系统的发酵罐中，接种量10%，发酵过程中使用碳酸氢钠溶液维持发酵系统的pH值为5.5~6.5，温度为37~39℃，直到体系中葡萄糖含量降低至5g/L；

CGMCC 1593发酵系统的发酵液量为步骤（2）基因工程菌CCTCC NO：M 2012041菌种的发酵系统发酵液量的15%~30%；

在CCTCC NO：M 2012041菌种的发酵系统将葡萄糖消耗殆尽后，将发酵液升温至60~70℃，停留时间为30min，使体系中的CCTCC NO：M 2012041菌种彻底失活；将CGMCC 1593发酵系统的发酵液接入CCTCC NO：M 2012041菌种发酵罐中，维持发酵系统的pH值为5.5~6.5，温度为37~39℃，24h后，体系中还原糖含量降低至5g/L；

发酵液中还原糖含量、丁二酸含量均使用液相色谱测定，总的发酵体系中葡萄糖含量为<2g/L，戊糖含量<2g/L，综合糖酸转化率>90%。