[发明专利]一种基于几何平均荧光指数检测弱抗原表达水平的方法

说明书

技术领域

本发明涉及流式细胞术技术领域，更具体地讲，涉及一种利用流式细胞仪基于几何平均荧光指数检测弱抗原表达水平的方法。

背景技术

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。它以激光为激发光源，可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术，被广泛应用于医学临床以及各个生物研究领域。当前，绝大多数流式细胞仪在理论性能参数上认为能检测到单个细胞上低至100个荧光分子数的弱抗原。但是在实际工作中，不同实验室对这类弱抗原表达的结果判断存在很大偏差。

目前在实际操作中，通常会通过常规设置同型对照或阴性对照的方法来判定目的抗原的表达。这对于强阳性和阴性标本容易判断，但抗原表达量低时，结果很难判断。即使在操作中选用荧光强度最强的荧光素如藻红蛋白(PE)和别藻青蛋白(APC)标记的单抗也无法改善结果。也有研究者尝试采用间接标记法来改善抗原表达弱的数据分析问题。但间接标记法一方面耗时长，增加了细胞的丢失；另一方面非特异性荧光背景强，因此该方法并不适合临床标本和细胞数少的样本的检测。

平均荧光强度是目前检测弱抗原表达水平最常用的统计学指标。但对于小样本事件来说，分析者无法通过抗原表达强度高于同型对照的多少去判断结果有无统计学差异。因此，如果能研发一种简单客观的统计分析方法，最大限度地减少检测弱抗原表达的实验误差和主观判断误差，将会有效推动流式细胞术在多应用领域的实用价值。

发明内容

针对上述现有技术中流式细胞仪无法准确检测弱抗原表达的问题，本发明提供了一种利用流式细胞仪检测弱抗原表达水平的方法。该方法基于几何平均荧光指数可以增加弱抗原检测的准确性，避免人为的误差。

为实现上述的发明目的，本发明采用如下的技术手段：一种基于几何平均荧光指数检测弱抗原表达水平的方法，包括以下步骤：

(1)将目的细胞进行免疫荧光染色；

(2)设置流式细胞仪性能参数，上机检测分析；设置待测荧光通道的分辨率；轻微调节电压，使待测抗原同型对照或阴性细胞的几何平均荧光强度为一固定值后，获取阳性细胞和目的细胞待测抗原的几何平均荧光强度，计算出该抗原的几何平均荧光指数；

(3)数据分析：若目的细胞待测抗原几何平均荧光强度指数高于同型对照几何平均荧光强度指数，则为待测抗原表达。

所述几何平均荧光指数为：

所述待测荧光通道的分辨率设置为小于等于256。

所述目的细胞为浓度为±106细胞/100μL的单细胞悬液。

所述抗原为单个细胞上至少100个荧光分子数的弱抗原。

与现有技术相比较，本发明具有以下几个方面的优点：

(1)采用降低荧光通道分辨率的技术思路，有效避免了后期数据分析中由人为因素造成的实验误差，提高了结果判断的真实性和客观性；

(2)采用几何平均荧光指数，对偏态分布和细胞数极低的抗原表达结果更具统计学意义；

(3)建立一个新的流式统计学指标：几何平均荧光指数，有效避免了仪器在不同时间段可能存在的电压等仪器参数的轻微偏差，以及不同时间点不同批次样本对结果的影响，提高了对目的细胞测定的准确度和精确度。

附图说明

图1a为细胞分布呈正态分布的示意图，1b为细胞分布呈偏态分布的示意图。

图2显示了实施例1慢性淋巴细胞白细胞外周血样本的CD5+CD19+细胞/同型对照gG1-PE(FL2通道)双参数图几何平均荧光强度为10.31；可同时观察到算术平均荧光强度为23.56，两者存在明显差异。

图3为实施例1慢性淋巴细胞白血病外周血样本中肿瘤细胞中ZAP-70-PE与同型对照IgG1-PE的拟合图(黑色分布为同型对照，黑色线为ZAP-70)，分析后几何平均荧光指数为1.16，判断肿瘤细胞表达ZAP-70。

图4为实施例1慢性淋巴细胞白血病外周血样本中肿瘤细胞中ZAP-70-PE与同型对照IgG1-PE的拟合图，分析后几何平均荧光指数为0.36，判断肿瘤细胞不表达ZAP-70。

图5显示了实施例1(图5a)和对比例1(图5b)对IgVH位突变慢性淋巴细胞白血病ZAP-70的检测结果，前者为ZAP-70阳性(几何平均荧光指数为0.71)，后者为阴性(ZAP-70：18.7％)。