[发明专利]一种磷脂的电致化学发光检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种磷脂的电致化学发光检测方法及其应用。

背景技术

磷脂为两性分子，两端分别为含氮或磷的基团、疏水长烃链，在细胞信号和细胞凋亡中起到重要作用。根据不同碱基及脂肪酸的数量，磷脂可以分为卵磷脂(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)，其骨架由甘油组成。磷脂可以进行水解、羟基化、乙酰基化、磺化、活化等反应。

磷脂的代谢与甲基化循环相关，在生物体内磷脂可经各种磷脂酶水解为脂肪酸、磷酸、甘油和各种氨基醇。甘油可转变为磷酸二羟丙酮从而参与糖的代谢，磷酸，人们体内物质各种代谢不可缺少的物质，氨基醇可以参加体内磷脂再合成，胆碱还可以通过转甲基作用转变为其他组份。对于磷脂的合成，通过乙醇胺或胆碱与ATP作用生成磷酸乙醇胺或磷酸胆碱，再与CTP作用转变为胞二磷乙醇胺或胞二磷胆碱，接下来再与已经生成的甘油二酯合成相应的磷脂。

对于磷脂的分析，传统的分析方法检测方法有很多，如分光光度法测定磷元素，这是基于含钼试剂和磷脂进行显色反应产生蓝色产物；色谱技术如薄层色谱法、高效液相色谱法及气相色谱法也可用于磷脂的检测，与显色法对比，色谱法干扰少，方便快捷，可以将混合磷脂中各个组份分别分离出来并定量，同时可测磷脂在储存过程中是否发生水解和氧化；现在高效液相色谱法和质谱法联用是检测磷脂最常用的方法，Lewen Jia等(Jia L，Wang C，Kong H，et al.Plasma phospholipid metabolic profiling and biomarkers of mouse lgA nephropathy[J].Metabolomics，2006，2(2)：95-104)用质谱串联液相色谱四级杆复合线性离子阱，采用二醇色谱柱，通过调节流动相组成，实现了血浆中磷脂的快速分离，赵素敏等(赵素敏，郑虹，路鑫等，基于液相色谱与质谱联用的代谢组学及磷脂轮廓分析在糖代谢异常研究中的应用)利用高效液相与质谱联用分析到糖尿病血浆中代谢组学及磷脂轮廓原始谱图，根据模型及相关数据的分析筛选出差异性代谢物。尽管上面研究磷脂的方法已经很多了，但这些技术都无法应用于检测单细胞中的磷脂。鉴于细胞的个体差异性，能够检测出单个细胞表面的磷脂 分子含量，对于很多脂类疾病的研究具有重大意义。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种磷脂的电致化学发光检测方法，该方法可用于测定细胞表面磷脂，同时还可以测定单个细胞表面磷脂，检测灵敏度高、专一性好。

技术方案：为实现上述技术方案，本发明提出一种磷脂的电致化学发光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将待检测磷脂浸泡在低离子强度溶液中使磷脂活化，然后将活化后的磷脂用磷酸缓冲液冲洗并浸泡待用；

(2)将经步骤(1)处理后的待检测磷脂浸入含有鲁米诺或L012的磷酸缓冲液中，以ITO为工作电极，Ag/AgCl、Pt分别为参比电极和对电极，利用电致化学发光法检测发光强度I₀，然后向其中加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，反应1～2min以后，再次检测发光强度I₁，计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化I₁/I₀。

其中，步骤(1)中，所述的低离子强度溶液为包含0.5mM磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)和310mM蔗糖的低离子强度溶液。

步骤(2)中，鲁米诺或L012的浓度为180～200μM；磷脂酶D的浓度为8～10U/ml；胆碱氧化酶的浓度为1～5U/ml，优选地，磷脂酶D和胆碱氧化酶的体积比为3∶7。

具体地，所述的电致化学发光法的检测过程为：在ITO表面黏上一个O型圈，向O型圈内加入待检的磷脂和鲁米诺的磷酸缓冲液，在ITO上加扫描速度为1V/S，-1.0V～1.0V的电压，光电倍增管电压为500V，记录背景发光强度I₀；待基线平稳后，暂停，从上端静态注射入口向O型圈内再加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，等待反应1～2min后继续记录发光强度I₁，计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化I₁/I₀。

本发明进一步提供了一种细胞磷脂的电致化学发光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将待检测细胞浸泡在低离子强度溶液中使细胞表面磷脂活化，然后将活化后的细胞用磷酸缓冲液冲洗并浸泡待用；