[发明专利]一种双miRNA抑制表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种双miRNA抑制表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

RNA是生物体内一种重要物质，在生命活动中发挥着各种各样的功能。根据是否编码蛋白质，RNA可分为信使RNA(messager RNA，mRNA)和非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。小RNA(small RNA，smRNA)是一类重要的ncRNA。miRNA是生物体内一种内源性小RNA，长度一般为20-24nt。miRNA是pri-miRNA(primary RNA)的一部分，最初在细胞核中由RNA聚合酶Ⅱ转录表达。成熟的miRNA作为引导性分子，根据碱基配对原则与靶基因mRNA结合，引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译，从而发挥对靶标基因表达的负调控作用。

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)有“牧草之王”的美誉，是世界上被广泛种植的一种重要的饲料作物。由于紫花苜蓿粗蛋白含量在21.8％～37.6％之间，远高于小麦、玉米等粮食作物的粗蛋白含量，对保证奶牛产奶质量具有重要意义。我国许多地区都存在不同程度的干旱和盐渍化问题，为了优先保证粮食产量我国主要将苜蓿等牧草种植于受干旱、盐渍化等影响的贫瘠土地上，因此提高苜蓿抗逆性对提高苜蓿产量，进而保障我国牧草供应具有十分重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种结构简单、成本低、操作简便的双miRNA抑制表达载体。

一种部分重叠的互补引物对，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

一种将本发明所述的部分重叠的互补引物对同时作为引物和模板扩增得到的序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

一种双miRNA抑制表达载体，其包括本发明所述的序列SEQ ID NO:3。

本发明所述双miRNA抑制表达载体在提高苜蓿抗逆性中的应用，所述双miRNA抑制表达载体转化苜蓿后能同时抑制苜蓿中Ms-miR393和Ms-miR398的表达，进而提高苜蓿中靶标基因MsTIR1、MsAFB2、MsCSD1和MsCSD2的表达，最终使苜蓿的耐盐、抗旱等抗逆性得到增强。

一种本发明所述的双miRNA抑制表达载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)根据苜蓿Ms-miR393和Ms-miR398序列以及miRNA海绵技术原理，设计权利要求1所述的部分重叠的互补引物对Seq1和Seq2，所述Ms-miR393和Ms-miR398序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，所述Seq1和Seq2序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；Seq1序列对应的转录产物包含Ms-miR393-sponge和Ms-miR398-sponge，核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，它们分别与Ms-miR393和Ms-miR398存在2～3个碱基不能完全互补配对，进而形成发夹结构；

(2)用ddH₂O将Seq1和Seq2配制成10μM浓度溶液，将Seq1和Seq2同时作为引物和模板进行重叠延伸PCR反应，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，30循环；72℃延伸5min；

经琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小为400～1000bp的弥散条带，主条带大小为600～800bp；将主条带进行切胶回收，连接到克隆载体pEASAY-T1上获得重组载体pEASAY-T1-Seq3，转化大肠杆菌，在含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上筛选出阳性克隆并测序，选出插入序列Seq3含有8～10个重复Seq1序列的阳性克隆，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，将阳性克隆大肠杆菌进行扩大培养并提取质粒，使用Xba I和BamH I双酶切后进一步将Seq3片段连接到植物表达载体pBIGFP上，获得双miRNA抑制表达载体pBIGFP-Seq3。