[发明专利]IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法

权利要求书

1.一种IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法，其特征在于，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法利用ELISA方法检测血浆或血清中IL-11的表达；IL-11属于IL-6因子家族；

具体包括以下步骤：

步骤一，采用血浆/血清样本，用EDTA抗凝/无抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，室温静置5分钟后，4000rmp/min，离心5分钟，获取上清备用；样本通常24小时内完成检测，对于复查的标本；标本离心后，放置-80℃冰箱长期保存备用；所有的试剂和样本在使用之前放置在室温18℃-25℃；所有的样本复空；

步骤二，用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，对血浆/血清样本1∶2稀释；

步骤三，用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，溶解IL-11蛋白质标准品粉末，充分震荡混匀后；制备成4ng/ml的标准品；取100ul的4ng/ml的标准品，加入400ul的稀释液，配制成800pg/ml的标准品，在6管分别加入400ul的稀释液，800pg/ml的标准品中移出200ul，进行倍比稀释，分别得到266.7pg/ml、88.89pg/ml、29.6pg/ml、9.88pg/ml、3.29pg/ml、0pg/ml；

步骤四，加入100ul的标准品于IL-11抗体包被的96孔板中，血浆/血清/细胞上清/其他体液样本1∶2稀释，用薄膜覆盖孔后，室温孵育2.5小时或者4℃过夜，并轻微震荡；

步骤五，用pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，将山羊抗人IL-11抗体稀释为2μg/ml；在聚苯乙烯的96孔酶标板的微孔中加入50μl包被液，用保鲜膜封好，在4℃冰箱中放置过夜；次日，用350μl 150mM的PBST缓冲液浸泡式洗板，3min×3次；

步骤六，每孔加入300μl的2％BSA，室温封闭4h；用350μl PBST缓冲液浸泡式洗板，1min×3次；

步骤七，丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中彻底清除液体；在最后一次洗涤时，去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在吸水纸上排干；共洗涤4次；

步骤八，在每孔中加入100ul生物素标记的IL-11抗体，室温孵育1小时，并轻微震动；丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中清除液体；在最后一次洗涤时，去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在吸水纸上排干；共洗涤4次；

步骤九，加入100ul链亲和素溶液于每孔中，室温孵育45分钟并震荡；丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均需从孔中清除液体；在最后一次洗涤时，去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在吸水纸上排干；共洗涤4次；

步骤十，加入100ul的TMB底物试剂于每孔中，室温避光震荡孵育30分钟；加入50ul 2M H₂SO₄溶液终止反应；在酶标仪Model 680酶标仪中读取450nm吸光值；

步骤十一，结果的判读：首先确定3个阴性对照孔的读数，取平均值作为本底读数；对于每一例血浆/血清/细胞培养液/其他体液样品或IL-11标准品，先计算3个平行孔的孔间变异系数CV，对于CV值小于10％的样品，取3次重复的平均值作为样品的OD值；CV值大于10％的样品，去除一个异常值后，重新计算孔间变异，孔间变异＝两孔OD值之差/两孔OD值之和，变异值＜12％，样品为有效病例，并取两孔平均值作为样品的OD值，否则，舍弃该例样品，利用梯度稀释的IL-11标准品绘制标准曲线，从而计算出每一例有效病例的血浆/血清/细胞培养液/其他体液的IL-11浓度。

2.如权利要求1所述的IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法，其特征在于，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法的IL-11属于IL-6因子家族，影响炎症因子趋化作用、癌细胞的运动和侵袭作用。

3.如权利要求1所述的IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法，其特征在于，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法检测的标准和方法：

辅助诊断胰腺癌：血清中CA19-9未检测明显升高的患者，用EDTA抗凝/无抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，在24h内完成血浆/血清的IL-11检测；

预后的评估作用：对于临床病理学明确诊断的胰腺癌患者，通过检测血浆中IL-11的表达水平评价胰腺癌患者的预后情况，用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，在24h内完成IL-11血浆检测，患者在未经过任何治疗措施前用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，在24h内完成血浆/血清的IL-11检测；在胰腺癌患者在手术后、化疗后、放疗后3-7天检测血浆/血清中IL-11的表达水平，或者在手术后、同步放化疗后检测血浆/血清中IL-11的表达水平，最后，根据血浆/血清的IL-11的表达水平评价胰腺癌患者的预后情况。