[发明专利]一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法

说明书

技术领域

本发明公布了一种将胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的有效方法，属于再生医学技术领域。

背景技术

我国是肝病大国，每年因终末期肝病死亡者人数众多。目前，肝硬化、原发性肝癌、代谢性肝病等终末期肝病的治疗主要依赖于原位肝移植，原位肝移植仍然是治疗终末期肝病最有效的措施，但由于存在供肝严重短缺、免疫排斥和长期服用免疫抑制剂带来多种毒副作用等缺点，其临床应用受到很大抑制。以肝细胞移植（Hepatocyte transplantation，HT）作为原位肝移植的替代治疗是一种可用于治疗肝脏疾病的可行方案，但亦面临着肝细胞资源缺乏、体外培养的肝细胞增殖能力差等缺点限制了其应用。干细胞的研究为解决上述问题提供了新的思路。

胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）因其具有无限的增殖能力和分化为各个胚层细胞的潜能，是细胞替代治疗临床疾病理想的种源细胞。特别是ESCs分化为肝细胞样细胞（hepatocyte-like cells, HLCs）的研究，可为临床细胞替代治疗提供合适的细胞来源，亦在药物评估和肝脏发生等基础研究方面起重要作用。目前国内外已报道了人(Cai et al, 2007; Lavon et al, 2004)和小鼠(Gouon-evans et al, 2006; Hamazaki et al, 2001) ESCs体外分化为肝细胞或肝样细胞的研究，这些分化的细胞在形态上与成体肝细胞相似，并表达肝细胞相关的基因和蛋白，有些分化得到的细胞还具备肝细胞的功能，这些研究为以ESCs为种源细胞进行肝细胞替代治疗研究奠定了良好的基础。

近年来，ESCs的诱导分化已形成了多种方法和技术体系，其中以分化过程可分为：1.胚胎干细胞自发分化；2.胚胎干细胞直接以诱导剂诱导期分化；3.胚胎干细胞先形成拟胚体（EB），之后将一个球形EB直接接种，再添加各种诱导剂来诱导分化。在他们的研究中，主要通过4个阶段的诱导实现ES细胞向功能性肝细胞的分化，即内胚层的诱导分化、肝特异性细胞的诱导分化、成肝细胞的扩增和肝细胞的成熟。在这一过程中，每个阶段所要依靠的细胞因子各不相同，常用的早期诱导因子有激活素A、丁酸钠SB等。激活素A 可通过激活activin/nodal 信号通路诱导ESCs向内胚层分化。常用的中期诱导因子有HGF、FGF、BMP、DMSO 等。HGF可通过激活c-Jun 通路促进肝脏发育。FGF家族中与肝脏发育相关的主要因子有FGF2、FGF4、FGF7，来源于横隔间充质的BMP2和BMP4可与FGF联合诱导肝脏分化。晚期促成熟因子主要包括OSM和地塞米松，前者通过gp130信号转导通路诱导肝脏成熟，后者参与肝脏糖异生。

人类ESCs可以自发形成拟胚体，然后自发分化为各种组织特异性细胞系，其中10~30％分化成肝细胞和肝细胞样细胞；通过富集拟胚体的内胚层，分化成肝细胞和肝细胞样细胞的效率增长到50~65%；而目前在iPSC和ESC分化成肝细胞的过程中，持续添加各种组织特异性生长因子，其分化效率可达60~80%，诱导过程所需时间太长，需要20天左右；而缩短诱导时间，诱导效率则明显下降。早期诱导因子丁酸钠是一种细胞周期阻抑化合物（组蛋白脱乙酰化酶抑制剂），在诱导过程中会使细胞大量死亡，需要大量的hESCs才能诱导出少量的肝细胞。目前，诱导成功的肝细胞尽管满足了某些实验的需求，但是，对于临床要求来讲，还具有较大的距离。所以，如何在此基础上进一步优化，也是近年来研究人员一直在探讨的问题。