[发明专利]一种转基因玉米MON810的恒温探针法检测引物组、检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物品种的检测试剂盒及其检测方法，具体涉及一种转基因玉米MON810的恒温探针法检测引物组、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

自转基因作物投入商业化种植来，全球转基因作物种植面积累计已经超过10亿公顷。2010年，全球29个国家的1540万农民种植了共1.48亿公顷的转基因作物。自1996年至2010年，全球转基因作物的种植面积增加了87倍。种植转基因作物排名前十位的国家种植面积首次均超过了100万公顷。目前，世界各国已进行田间试验的转基因作物超过5000种，批准商品化的转基因作物有160多种，包括玉米、大豆、油菜、番茄、马铃薯、甜椒、木瓜、甜菜、烟草、水稻等。从世界范围看，转基因的推广已经带来了巨大的社会和经济效益。然而转基因玉米在带来巨大社会和经济效益的同时也存在许多问题，主要集中在转基因食品的安全性以及对生态环境的安全性方面，包括对人和动物健康的风险，对生态环境与农业的风险，对非目标生物的风险。近来在全球范围内引起场转基因生物安全性的争论，支持和反对两派争锋相对，势不两立，为便于消费者区分及选购，各国分别提出对转基因食品进行标识管理，并对最低含量作出规定。因此建立快速有效的检测方法体系，对作物及食品进行区分尤为重要。

目前转基因作物的检测主要是检测样品是否含有外源蛋白质（基因表达产物）和是否含有外源基因（DNA）。转基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫原理的酶联免疫吸附法（ELISA）试纸条检测、Western杂交等方法检测，但是这种方法要求高质量高稳定性的抗体，否则因准确性不够，只能作为辅助检测手段，另因检测靶标是蛋白，经深加工的食品蛋白已发生变性，故外源蛋白质检测方法对于深加工的食品检测具有一定局限性。转基因作物的核酸检测方法主要有PCR检测技术、恒温检测技术。然而PCR检测技术存在如下问题，1）PCR方法反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；2)所需PCR仪价格昂贵，检测时间长；3)电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性，且难以实行现场检测，所以PCR检测技术在基层仍未得到推广应用。

恒温基因扩增技术具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，自建立来已得到广泛的应用，并在原基础上发展出采用SYBR Green染色法、钙黄绿素法、浊度法、荧光染料法等不同结果伴读方法，适合现场及快速检测，已在基层得到推广应用，但所采用的SYBR Green染色法、钙黄绿素法、浊度法、荧光染料法等在检测原理上具有先天的不足，都以核酸扩增产物或副产物为靶标进行直接检测，如检测中所发生的是非特异扩增，检测结果仍为阳性结果，即以上的测试方法存在检测结果为假阳性的问题（特异性差的问题），开发一种可避免假阳性的转基因检测试剂盒是目前亟待解决的难题。

为避免假阳性扩增，本发明在检测引物组中引入特异性分子探针，该探针可实时与产物扩增产生的靶标片段特异性结合并发出荧光信号，如扩增产物为非靶标基因，该探针不与扩增的产物进行结合，无荧光信号发出，检测结果仍为阴性。该检测方法克服恒温检测技术的不足，将进一步引领恒温检测技术的在检测中的推广应用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种转基因玉米MON810的恒温检测试引物组。

本发明的另一个目的在于提供一种转基因玉米MON810的恒温检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一种转基因玉米MON810的恒温检测方法。。

本发明所采用的技术方案如下：

转基因玉米MON810的恒温检测引物组，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2、环引物和探针引物，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物1：5’-CATCGTTGAAGATGCCTCT-3’；

外引物2：5’-GTACCGAAGACGGTAGATCT-3’；

内引物1：5’-CGTCATCCCTTACGTCAGTGGAAGAAGACGTTCCAACCAC-3’；

内引物2：5’-CCTTCGCAAGACCCTTCCTCGCTAGAGTCAGCTTGTCAG-3’；

环引物：5’-CATTTCATTTGGAGAGGACACG-3’；

探针引物：FAM-ATCGACATCAATCCACTTGCTTTTCGAT-BHQ-1。

一种转基因玉米MON810的恒温检测试剂盒，其包括如上所述的恒温检测引物组。

所述试剂盒中还包括：DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。