[发明专利]高空间分辨激光分光瞳共焦光谱‑质谱显微成像方法与装置

说明书

技术领域

本发明属于共焦显微成像技术、光谱成像技术和质谱成像技术领域，将分光瞳共焦显微成像技术、质谱成像技术和光谱探测技术相结合，涉及一种高空间分辨激光分光瞳共焦光谱—质谱显微成像方法与装置，可用于生物质谱的高分辨成像。

技术背景

质谱仪(Mass Spectrometry)是将样品中的组分发生电离，使生成的不同荷质比的带电原子、分子或分子碎片在电场和磁场的作用下分别聚焦而得到按质荷比大小顺序排列的图谱仪器。质谱成像是对样品二维区域内多个微小区域分别进行质谱分析来检测特定质荷比(m/z)物质的分布。

自上世纪80年代中期基质辅助激光解吸电离这种高灵敏度和高质量检测范围生物质谱成像技术的出现，开拓了质谱学一个崭新的领域—生物质谱，促使质谱技术应用范围扩展到生命科学研究的众多领域，特别是质谱在蛋白质、核酸、糖蛋白分析等方面的应用，不仅为生命科学研究提供了新手段，而且也促进了质谱技术自身的发展。

但现有基质辅助激光解吸电离质谱仪存在以下突出问题：

1)由于利用简单的激光聚焦来解吸电离样品，因而其仍存在激光聚焦光斑大、质谱探测空间分辨力不高等问题；

2)无法对中性原子、分子、中离子及基团等进行探测，其结果制约了样品质谱成分的准确完整获取；

3)质谱成像所需时间长，激光质谱仪聚焦光斑轴向位置相对被测样品常发生漂移问题。

而生物样品“微区”完整组分信息的准确获取对于生命科学研究具有极其重要的意义。事实上，如何高灵敏地探测微区质谱信息是目前生物质谱领域亟待研究的重要技术问题。

事实上，强脉冲激光聚焦到样品表面会使样品离子化，可激发出带电的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中离子等。如何能够完整地获取带电的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中离子的信息，对于高精度分析样品的组分具有重要意义。

利用激光诱导击穿光谱(LIBS)技术可测量等离子体发射光谱信息，获得样品中元素成分。将激光诱导击穿光谱(LIBS)技术与质谱探测技术相结合，可用来弥补激光质谱成像技术中无法获得中性原子、分子和中离子信息的不足。

激光共焦显微镜“点照明”和“点探测”的成像探测机制，不仅使其横向分辨力较同等参数的光学显微镜改善1.4倍，而且还使共焦显微镜极便于与超分辨光瞳滤波技术、径向偏振光紧聚焦技术等结合来压缩聚焦光斑，进一步实现高空间分辨显微成像。

基于此，本发明提出一种高空间分辨力的激光分光瞳共焦光谱-质谱显微成像方法与装置，其创新在于：首次将具有高空间分辨能力分光瞳共焦显微技术与激光诱导击穿光谱(LIBS)技术和质谱探测技术相融合，可实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形态与组分的成像与探测。

本发明一种高空间分辨激光分光瞳共焦光谱—质谱显微成像方法与装置可为生物质谱高分辨成像提供一个全新的有效技术途径。

发明内容

本发明的目的是质谱成像的空间分辨能力、抑制成像过程中聚焦光斑相对样品的漂移，提出一种高空间分辨激光分光瞳共焦光谱-质谱显微成像方法与装置，以期同时获得被测对象成份空间信息和功能信息。本发明将激光分光瞳共焦显微镜聚焦光斑的探测功能与激光聚焦解吸电离功能相融合，利用经超分辨技术处理的分光瞳共焦显微镜的微小聚焦光斑对样品进行高空间分辨形态成像，利用质谱探测系统对分光瞳共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的带电分子、原子等进行微区质谱成像，利用光谱探测系统对分光瞳共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的等离子体发射光谱信息进行光谱成像，然后再通过探测数据信息的融合与比对获得完成的样品成分信息，继而实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形态与组分的成像与探测。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的。

本发明的一种高空间分辨激光分光瞳共焦光谱-质谱显微成像方法，其利用高空间分辨分光瞳共焦显微系统的聚焦光斑对样品进行轴向定焦与成像，利用质谱探测系统对分光瞳共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的带电分子、原子进行微区质谱成像，利用光谱探测系统对分光瞳共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的等离子体发射光谱进行探测，然后再通过探测数据信息的融合与比对分析继而实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形态与组分的同时成像与探测，包括以下步骤：

步骤一、使平行光束通过沿入射光轴方向放置的压缩聚焦光斑系统、D型照明收集镜中的D型照明光瞳聚焦到被测样品上解吸电离产生等离子体羽；