[发明专利]一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽，其特征在于该钙螯合肽的氨基酸序列为Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp，ESI/MS检测分子量为959.93Da。

2.一种权利要求1所述的一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）金枪鱼肝脏蛋白酶解液的制备：金枪鱼肝脏从冰冻金枪鱼鱼体中取出后，用高速组织捣碎机匀浆，并向匀浆中加入2~3倍体积的pH为7.0、浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，加热至50～60℃，恒温搅拌25～30min，然后按照肝脏湿重的0.5~1.0%向溶液中加入风味蛋白酶，酶解4~6h，然后将温度升至55～65℃，按照肝脏湿重的0.8~1.2%向溶液中加入中性蛋白酶，酶解3~6h后，9000r/min离心25～30min，取上清液，即为金枪鱼肝脏蛋白酶解液;

2）金枪鱼肝脏钙螯合肽的的制备：将制备的金枪鱼肝脏蛋白酶解液采用5kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有15～20倍AB-8大孔树脂的层析柱中，用5～8倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的95%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得到金枪鱼肝脏钙螯合肽；

所述步骤2）的凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：凝胶柱层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为20~25mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据225nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高Ca螯合活性的峰为凝胶层析酶解物；

RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（条件：进样量20~25μL；色谱柱为4.6mm×250mm，5μm的Kromasil C18；流动相：30%乙腈；洗脱速度1.0~1.5mL/min；紫外检测波长225nm），得到对钙离子的螯合能力为 97.24μg/mg的螯合肽Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp。

3.权利要求1所述的一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽用于制备补钙药物和保健品中的用途。