[发明专利]利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法

权利要求书

1. 一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，其特征在于该方法的步骤如下：

（1）采用分子生物学方法构建用于家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1的质粒pBMRJP1，质粒pBMRJP1包含有作为外源基因的蜂王浆主蛋白1基因和红色荧光DsRed标记基因表达框；

（2）采用显微注射转基因家蚕方法将pBMRJP1质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用piggyBac转座子将蜂王浆主蛋白1基因插入到家蚕基因组内；

（3）蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代成为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；

（4）G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；

（5）G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；

（6）从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的方式再连续3代进行选择和交配，育成红眼基因和蜂王浆主蛋白1基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕；

（7）通过该转基因家蚕后部丝腺细胞合成分泌蜂王浆主蛋白1，该蜂王浆主蛋白1随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。

2. 根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，其特征在于：所述的质粒pBMRJP1是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，质粒pBMRJP1包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框；一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3 Promoter –DsRed-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白轻链基因启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六个组氨酸标签His-Tag、肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列、蜂王浆主蛋白1基因和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Fibroin L chain Promoter-Fibroin L chain signal peptide-His tag-DDDDK-MRJP1- Fibroin L chain PolyA，六个组氨酸标签His-Tag用于提纯外源蛋白，肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列用于去除六个组氨酸标签。

3. 根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，其特征在于：所述的辅助质粒pHA3PIG质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座臂PBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3 Promoter-transposase- SV40 PolyA。

4. 根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，其特征在于：所述的蜂王浆主蛋白1基因在家蚕后部丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻链信号肽的作用下分泌到后部丝腺腺腔，并依次进入中部丝腺、前部丝腺直到蚕茧。