[发明专利]一种细胞增殖速率的测定方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞增殖速率的测定方法及应用，属于细胞工程技术领域。

背景技术

细胞增殖速率测定是细胞生物学领域最基础的实验方法，传统的化学方法精度不高，现有的流式细胞仪测定技术(如BrdU法，PCNA法等)，虽然解决了测量精度的问题，但是BrdU法和PCNA法都依赖于特殊标记的抗体，这些抗体价格昂贵且具有种属特异性，这就大大限制了这两种方法的应用范围。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种细胞增殖速率的测定方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种细胞增殖速率的测定方法，该方法是在培养细胞的不同时间点分别取样，利用秋水仙素对所取样品进行处理，处理后利用乙醇固定细胞，再利用流式细胞仪对固定细胞进行细胞周期检测，同时检测未经秋水仙素处理的空白对照组的细胞周期，计算细胞增殖速率，绘制细胞生长曲线，再利用细胞生长曲线确定待测细胞的增殖速率。

所述方法的步骤如下：

1)在含有5％CO₂培养箱中培养细胞，并在细胞生长的不同时间点取样；

2)利用秋水仙素对步骤1)取样的细胞进行处理，处理结束后静置备用，同时设置未经秋水仙素处理的空白对照组；

3)利用乙醇对步骤2)所得的处理样品及对照组样品进行固定处理，获得固定细胞；

4)利用流式细胞仪测定步骤3)所得的固定细胞的细胞周期，并计算细胞的增殖速率，绘制细胞生长曲线；

5)利用步骤4)所得的细胞生长曲线测定待测细胞的增殖速率。

优选地，步骤1)所述细胞为鹿茸间充质干细胞；所述不同时间点，是在细胞培养的12h、24h、36h、48h、60h和72h取样；所述取样，是用直径100mm的培养皿取10⁶个细胞。

优选地，步骤2)所述秋水仙素处理，是利用终浓度80-120μg/ml的秋水仙素对细胞进行处理。

更优选地，所述秋水仙素处理，是利用终浓度100μg/ml的秋水仙素对细胞进行处理。

优选地，步骤2)所述静置，静置的时间为6h。

优选地，步骤3)所述固定处理，是利用70％的乙醇固定细胞。

优选地，步骤4)所述利用流式细胞仪测定细胞周期，固定好的细胞样品用PBS洗涤，PI染色后，用流式细胞仪分析G2/M期细胞比例。

所述方法的具体步骤如下：

1)在含有5％CO₂培养箱中培养鹿茸间充质干细胞，并在细胞生长的12h、24h、36h、48h、60h和72h取样；

2)利用终浓度100μg/ml的秋水仙素对步骤1)获得的细胞样品进行处理，处理后静置6h，同时设置未经秋水仙素处理的空白对照组；

3)利用70％的乙醇对步骤2)所得的处理样品及对照组样品进行固定处理，获得固定细胞；

4)利用流式细胞仪测定步骤3)所得的固定细胞的细胞周期，并计算细胞的增殖速率，绘制细胞生长曲线；

5)利用步骤4)所得的细胞生长曲线测定待测细胞的增殖速率(如图1)。

所述任一方法用于测定细胞的增殖速率和生长曲线。

本发明获得的有益效果如下：

本发明选用常规细胞分裂阻断剂--秋水仙素阻断细胞周期，与标记抗体相比，秋水仙素价格低廉，并且没有种属特异性。利用流式细胞仪测定样品细胞周期的分布，比较秋水仙素加入前后细胞周期的变化ΔG2/M，评估细胞增殖速率，通过连续测定不同时间点的ΔG2/M绘制生长曲线。通过与常规检测方法MTT法和细胞计数法的比较，ΔG2/M的结果细胞计数法的结果一致，此方法比MTT法更准确。

与现有技术相比，本发明是在保证流式细胞仪精度的基础上，大大降低测定成本，拓宽了应用范围。

附图说明

图1为依据ΔG2/M绘制生长曲线。

图2为根据本发明方法、MTT法和细胞计数法绘制的生长曲线；

(AP：鹿茸间充质干细胞，FP：脸部骨膜细胞，293T：293T细胞)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例所使用的材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

实施例1

本实施例提供了利用MTT法和细胞计数法来绘制细胞生长曲线的方法，步骤如下：