[发明专利]一种支原体中药最低抑菌浓度检测新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种支原体中药最低抑菌浓度检测新方法。

背景技术

支原体是一种比较特殊的微生物，固体培养很困难，即使生长，其菌落也要借助倒置显微镜才能看清楚，又由于支原体的液体培养物是完全透明的，要靠其生长过程中的代谢产物改变液体培养基的pH值，并通过培养基中指示剂的颜色变化来判断支原体的生长情况。其中药药敏实验结果的判定比较困难，一般采用以下方法：微量稀释培养法：96孔细胞培养板中，先用新鲜的液体培养基将药液递倍稀释，共10个稀释度，再往各孔加入等量的菌液，同时设阳性、阴性对照，37℃培养，直至阳性对照孔发生颜色改变。以最低无颜色变化的孔的药物浓度定为最小抑菌浓度。但由于有些中药煎剂的色泽较深，如鱼腥草等，在药物稀释度较低时，仍使培养基染上颜色，往往影响肉眼观察，难以判断指示剂的色泽改变，可能使实验结果出现误差。颜色较深的中药，有的在其中加入活性炭进行吸附，可以降低颜色的深度，但怀疑会吸附掉一部分有效成分，从而影响实验结果。颜色深又需要准确抑菌浓度时，有的人采取：对怀疑的抑菌浓度，从中取出一定量培养物，加入到新鲜的液体培养基中重新培养一定的时间，看是否有支原体生长，来判定此浓度此浓度的抑菌效果。此方法费时费力。鸡毒支原体的MIC检测就出现了这一问题，鸡毒支原体是引起禽慢性呼吸道疾病的病原体之一，给养禽业造成重大的经济损失并影响产品质量。为了提高治疗效果和解决临床西药药残问题，体外筛选中药作为治疗药物。但因为中药药液的色泽较深和鸡毒支原体的生长特点，传统的药敏实验很难准确观察到检测液变色的临界点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的上述缺陷，对传统的药敏实验方法进行改进，利用其生长过程中的代谢产物改变培养基的pH值这一点，发明新方法，用pH计检测支原体培养物的pH值，通过pH值的高低来判定中药对支原体的最低抑菌浓度，提供一种支原体中药最低抑菌浓度检测新方法。

为解决上述技术问题，本支原体中药最低抑菌浓度检测新方法包括以下步骤：

步骤1)：取目标中药，将所述目标中药通过煎煮、浓缩为0.5g/mL的药液，高压灭菌；对待检支原体培养物进行复苏，并准备液体培养基；

步骤2)：取12支长度为7cm、半径为1.5cm的玻璃试管，灭菌后依次编号为“(-)、①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、(+)”，放入合适的试管架上；

步骤3)：向(-)试管中加入2mL步骤1)所述液体培养液；向①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、(+)11支试管中各加1mL步骤1)所述液体培养液；

步骤4)：向①试管中加入1mL步骤1)所述药液，将①试管中药液与液体培养液用移液器充分混匀，然后递倍稀释至第⑩管；

步骤5)：向①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、(+)11支试管中，各加入0.8mL液体培养液和0.2mL菌液的混合液；

步骤6)：将12支试管塞紧胶塞，在无光条件下于37℃恒温箱中培养7～15天培养；通过pH计来测定各管内培养物的pH值；

步骤7)：将经步骤6)处理的12支试管，通过精密pH计来测定(-)、①～⑩、(+)管内培养物的pH值，取依次记录数据；

①～⑩试管数据为一先升后降的pH变化趋势，找到其下降阶段数据中，第一个与(-)试管数据差值大于等于-1的试管，该试管的前一试管中的药物浓度，即为最低抑菌浓度。

作为进一步说明，步骤1)所述的待检支原体培养物复苏方法为，将冻存的支原体菌种融化后，按一定质量比1:9比例加到新鲜的培养液中，于37℃培养，即可复苏支原体。

作为进一步说明，步骤1)所述的液体培养基为改良Freg氏液体培养基，其原料配方为，NaCl—5.0g、KCl—0.4g、MgSO₄.7H₂O—0.2g、Na₂HPO₄.12H₂O—1.6g、KH₂PO₄—0.2g、葡萄糖—10g、乳蛋白水解物—5g、酵母粉—5g、1﹪半胱氨酸溶液—10mL、2﹪精氨酸溶液—20mL、猪血清—100mL、1﹪粉红溶液—1.0mL、10万单位/mL青霉素—10mL、1﹪醋酸托溶液—10mL；称取上述各成分，加水至1000mL用1.0﹪mol/L的NaOH调pH值至7.6～7.8，0.22um孔径筛滤、除菌、分装，﹣20℃保存。