[发明专利]一种制备α-1,3GT基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及制作基因敲除动物模型的领域，具体讲，涉及一种制备α-1,3GT基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用。

背景技术

由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性材料因其具有良好的生物相容性被广泛用于外科的创伤修复、组织重建和组织工程的支架材料等。异种器官也早已成为解决器官移植中供器官严重缺乏的潜在途径之一。然而，动物源性生物材料或异种器官组织应用于人体所带来的免疫学问题直接影响着这类材料使用的安全性和有效性。异种器官移植的最大障碍是供器官异种抗原与受者体内天然抗体结合后激活补体系统，攻击供器官而产生的超急性免疫排斥反应(Hyperacute rejection，HAR)，其发生时间在异种移植后的几分钟至数小时，供器官在短时间内发生功能衰竭使移植失败。动物源性生物材料虽经各种去除抗原的处理，却难以彻底去除所有的异种抗原，残留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反应和免疫毒性而影响创伤愈合的重要因素。

已有研究显示异种抗原α-半乳糖基抗原(α-1,3-galactosyle，α-Gal)是动物源性生物材料或异种器官移植超急性免疫排斥反应中的主要靶抗原。α-Gal是含有聚乳糖胺核心末端残基的细胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，广泛存在于猪和其它低等动物体内。α-Gal主要受α-1，3半乳糖基转移酶(α1,3-galactosyltransferase,α-1,3GT或GGTA1)及异红细胞糖苷酯合成酶(isoglobotriosylceramide synthase或isogloboside 3synthase,iGb3S)调控。由于人体及类人猿、旧世纪猴的半乳糖苷转移酶基因有2个碱基错位变异而不表达Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗α-Gal抗体(占总血清球蛋白的1％)，因此当人体接受含有Gal抗原的生物材料或异种器官移植时会导致超急性免疫排斥反应及慢性的免疫毒性反应。有研究证实人血清中的抗α-Gal抗体既与α-1,3GT催化的Gal抗原(糖蛋白)反应，也与iGb3S催化的Gal抗原(糖脂肪)反应。动物源性生物材料或异种器官移植中Gal抗原的去除成为降低免疫排斥和慢性免疫毒性反应的关键。目前，如何评价Gal抗原的去除和残留Gal抗原诱导的免疫毒性尚存在着瓶颈。由于野生型低等动物都表达α-Gal抗原，因此无法利用野生型低等动物去评价α -Gal抗原相关的免疫毒性反应，只能用狒狒作为受体来考察α-Gal抗原阳性或者异体器官的免疫毒性反应，而这种动物稀少很难普及使用。因此，如何评价动物源性生物材料或异种器官组织的免疫毒性存在着瓶颈。检测与监管机构因没有方法和标准可依据而无法进行有效的安全性和质量监控，同时也限制了该类产品的研发和产业化发展。

国际上早在90年代就有通过构建α-1,3GT基因敲除小鼠，来研究α-Gal相关的免疫学反应，探讨不含Gal抗原的克隆动物的构建方法和可行性。早在1996年，RG Tearle等报告了α-1,3GT基因敲除小鼠模型的成功制作方法，为α-1,3GT基因敲除克隆猪的构建开辟了先锋。之后开始有报告使用α-1,3GT基因敲除小鼠模型研究其与人所诱导抗体的相似性及其免疫学特征。Chiang TR等报告，α-1,3GT基因敲出小鼠免疫后诱导的抗-Gal抗体与α-Gal结合的亲和性和人的抗Gal抗体相似，是能够诱导Gal抗原阳性异种心脏补片的超急性免疫排斥反应。Chong A等报告，α-1,3GT基因敲除小鼠能够诱导自然的抗α-Gal IgM和IgG，并呈现周龄依存性增强；在同种异体或异种补片移植后可以观察到T-cell依存性的抗α-Gal抗体反应。这些研究提示α-1,3GT基因敲除小鼠模型对Gal抗原残留诱导的免疫毒性具有敏感的反应性。

α-Gal抗原引起的超急性免疫排斥反应和慢性免疫毒性的克服方法得到了深入研究。许多实验室采用了不同的方法对供器官或细胞进行处理，其中以酶处理法、物理化学分离法及交联法和基因改造等方法的研究最广泛。在2000年初研究者们开始了α-1,3GT基因敲除猪的研究，甚至α-1,3GT基因敲除牛的研究，期望能够直接从α-1,3GT基因敲除猪或牛获得没有Gal抗原的组织或器官，以避免动物源性生物材料及异种脏器移植的免疫排斥反应。Dai Y及Lai L等报道，他们运用核转移技术成功培育出了α-1,3GT基因敲除猪(GT/KO pig)。实验研究显示α-1,3GT基因敲除猪来源的生物材料能够显著减轻Gal抗原诱导的超急性排斥反应。