[发明专利]人3型腺病毒展示载体高通量构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人3型腺病毒展示载体的构建方法，具体地说，涉及一种人3型腺病毒展示载体高通量构建方法，属于生物医学技术领域。

背景技术

腺病毒颗粒，是一种无囊膜病毒，其为一种具有20面体对称结构的的病毒颗粒。其壳体由252个亚单位构成，其中240亚单位为6邻体构成的三聚体，能够刺激机体产生中和抗体以及组合型特异抗体。

之前我们发明了人3型腺病毒展示载体Golden gate的构建方法该，可以将外源片段插入到腺病毒6邻体高变区HVR1位置。但是，该方法是低通量的，因为单通道载体构建工作，往往需要做大量的重复工作，工作重复性和无序性常常导致载体构建工作中出现的样本交叉污染，给工作造成极大不便。另外，随着生物信息学的迅猛发展，目前高通量研究工作逐渐增多。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的在于提供一种基于Goldgen gate技术的人3型腺病毒展示载体高通量构建方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的：

该人3型腺病毒展示载体高通量构建方法，所述方法包括以下步骤：

1)将PCR片段或者合成的核酸片段，纯化后稀释测定浓度20ng-50ng/ul；

2)将步骤1)的PCR片段或者合成的核酸片段转移至96孔Golden gate反应预制板，与配置在所述96孔Golden gate反应预制板混合液进行Golden gate反应；

3)将步骤2)Golden gate反应产物转移至感受态细胞板中，进行Golden gate反应产物转化；

4)将步骤3)Golden gate反应产物转化后的细胞转移至大型LB固体培养基上，分离单克隆抗体；

5)挑取步骤4)制备的单克隆抗体，并培养后转移至96孔PCR克隆鉴定预制板，进行Golden gate反应产物克隆鉴定；

6)将步骤5)鉴定后的阳性克隆转移至96深孔板中，培养后提取克隆质粒，并测定克隆质粒浓度；

7)将质粒送测序。

上述的人3型腺病毒展示载体高通量构建方法，步骤1)所述的纯化采用微珠进行纯化。

上述的人3型腺病毒展示载体高通量构建方法，所述微珠为磁性微珠。

上述的人3型腺病毒展示载体高通量构建方法，每一份所述96孔Golden gate反应预制板反应混合液为1μL，包括如下重量组分：

上述的人3型腺病毒展示载体高通量构建方法，步骤3)中所述的感受态细胞板为96孔感受态细胞板。

上述的人3型腺病毒展示载体高通量构建方法，步骤4)中所述分离单克隆采用画线方式分离。

上述的人3型腺病毒展示载体高通量构建方法，步骤6)中所述克隆质粒采用96孔板质粒提取方法进行提取。

与现有技术相比，本发明提供的Golden gate载体构建方法及其涉及到的相关产品应用于高通量载体构建，相对目前单个载体构建而言，本方法实现了高通量、集约化、高效率和低成本等优点。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围之内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。

实施例1

1、将不同PCR产物或合成的核酸片段，采用Bioclone磁珠纯化试剂盒进行纯化后，通过Pico Green荧光分光光度法测定法高通量测定96孔酶标板上纯化后PCR产物浓度，其浓度范围50ng-150ng/ul。再分别加入在一块96孔PCR板上，与配置在96孔PCR板上Golden gate反应预制板混合液进行Golden gate反应。

2、96孔Golden gate反应

于96孔PCR板中统一配置Golden gate反应混合液。所添加的SfiI酶购于NEB公司。各项溶液配置如表1所示。

表1.Golden gate反应各项组份一览表SfiI酶