[发明专利]一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体及其筛选方法和应用

说明书

本发明公开一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体及其筛选方法和应用。在每轮筛选过程中，引入两次反筛的步骤，首先将前一轮的单链DNA文库与正常细胞结合，以去除与正常石斑鱼细胞结合的非特异ssDNA，然后将上清与被石斑鱼虹彩病毒感染的细胞进行结合筛选，从被石斑鱼虹彩病毒感染的细胞上分离得到的ssDNA，然后再和正常细胞结合，分离得到上清。PCR扩增文库制备出单链的DNA文库。重复以上的筛选流程，与第一轮筛选的正常细胞数目相比，将筛选过程中正常细胞的数目提高2‑6倍，与第一轮筛选的文库与细胞的结合时间相比，在随后的筛选过程中，文库与正常细胞结合时间从0.5h增加至1h，文库与病毒感染细胞结合时间从1h缩短至0.5h，以提高每轮的筛选效率。

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种可用于细胞水平和组织水平上石斑鱼虹彩病毒(SGIV)感染检测的DNA核酸适配体及其筛选方法和应用。

背景技术：

核酸适配体是由指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选得到的一类新型检测和治疗工具。指数富集的配基系统进化技术是一类广受关注的新型检测和治疗的生物文库技术。它利用人工合成的、容量约为10¹⁴～10¹⁵的随机寡核苷酸文库与靶物质结合，经过多轮筛选获得靶物质的核酸适配体。利用该技术筛选得到的核酸适配体具有与单克隆抗体相当的高特异性和高亲和性，由于筛选是在体外进行的化学过程，所以从金属离子、有机染料等简单体系，到病毒、细胞、组织等复杂体系，均可作为筛选对象，而且核酸适配体没有免疫原性，温度变化引起的变性是可逆的，筛选时间短费用低，得到的核酸适配体易于合成和修饰。因此，核酸适配体不仅在新药研发领域具有广阔前景而引人瞩目，其在重大疾病的生物医学基础研究、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。

我国是水产养殖大国，石斑鱼是最名贵的海水养殖鱼类之一，具有极高经济价值。然而，近年来在石斑鱼中暴发和流行的虹彩病毒等严重地威胁了石斑鱼的海水养殖，造成了巨大的经济损失。目前国际上在水产动物疾病，包括石斑鱼虹彩病毒快速诊断的方法主要包括基于细菌学、病毒学、寄生虫学及组织病理学的传统方法，基于抗体的免疫学检测方法，针对特异性病原的抗体的血清学检测技术以及分子生物学技术等。这些方法各有优点同时也存在严重不足，所以必须着力开发新型的、特异性更强、灵敏性更高、操作更简便的核酸适配体来检测和控制石斑鱼虹彩病毒(SGIV)感染。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种高特异性、高灵敏度、无免疫原性、稳定易修饰、便于合成和保存的用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体。

本发明的用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示，所述的核苷酸序列上结合有用于检测的标记。

上述DNA核酸适配体，其核苷酸序列上的任一位置可以被磷酸化、甲基化、氨基化、疏化或同位素化。

所述的用于检测的标记优选为：异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。

上述DNA核酸适配体，不论是经部分取代或者经过修饰后，都具有与原核酸适配体基本相同或者类似的分子结构、理化性质和功能，都可用于石斑鱼虹彩病毒(SGIV)检测。

本发明的第二个目的提供一种上述DNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、合成以下随机单链DNA文库和引物：

随机文库Library50：

5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC

5’引物：5’-FITC-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；