[发明专利]沙棘内生真菌及其提取物的制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种来源于长白山野生沙棘根内的一株真菌及在提高草坪草耐旱性上的应用。

背景技术

随着城市生态化建设进程的加快, 人们对城市绿地建设的要求也日益提高。草坪草植物作为一种优良的绿化物种, 在城市绿地建设中得到广泛应用。但是, 由于我国幅员辽阔, 地理气候条件复杂, 同一种草坪草在不同的地域常有着截然不同的生长表现。在寒冷、高温、干旱、水涝和盐碱等不良环境下,草坪草植物表现出一定限度的忍受能力。但是, 当逆境胁迫超过了草坪草的耐受范围时, 草坪草体内的酶受到破坏, 正常的代谢受阻, 导致生长发育终止甚至细胞死亡。通过各种人为管理措施( 如合理的施肥、灌溉等) 或先进技术手段( 如耐热、耐寒、抗病虫基因导入等) 的运用, 可最大限度地减缓或降低逆境对草坪草的伤害。

目前, 利用植物化学调控措施来改善草坪草生长和增强抗性是草坪研究中比较活跃的一个领域, 由于生长调节剂种类繁多, 使用上也有差异, 在施用过程中稍有不慎容易造成不必要的损害。

发明内容

本发明针对上述现有技术中存在的问题，提供了一种来源于长白山野生沙棘根内的一株内生真菌，从该真菌人工培养的菌丝内提取出能够提高草坪草耐旱性和产量的活性成分。

本发明的技术方案如下：

沙棘内生真菌为链格孢属（Alternaria Sp），保藏编号为CGMCC NO.10117，保藏日期为2014.12.11，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明沙棘内生真菌菌丝提取物的生产工艺包括如下步骤：

步骤1，沙棘内生真菌的分离：①健康的野生沙棘样品采集后立即处理、洗净，然后将沙棘根切成小段，用75%酒精冲洗，用10%巴氏消毒液洗18分钟，最后用无菌水冲洗4次；

② 将上述消毒冲洗过的沙棘根在无菌条件下分别切割成0.5cm长的小段接种于孟加拉红培养基平板上，置于25-30℃度培养箱培养3-7天后，即可见样品切割过的边缘长出菌丝，经平板反复分离、纯化；

步骤2，沙棘内生真菌液体发酵培养：

将上述步骤②中分离的真菌接到平板PDA培养基上，20-28℃培养4-8天 ，用打孔器琼脂挖块接种于装有50mLPDA的250mL三角烧瓶，于25-30℃，100-150r/min下旋转摇床上培养2-4天作为种子，以10%体积量接种到装有150mLPDA的500mL三角瓶中，于25-30℃，100-150r/min下旋转摇床上培养5天，终止发酵，放入4℃冰箱中保存备用；

步骤3，沙棘内生真菌提取物的制备：

将上述的菌丝体洗涤后50-70℃下烘干，称重，然后经高速粉碎机粉碎，粉碎后的菌粉与20wt%乙醇按体积比1:1混合浸提20-28h，浸提2-4次，用磁力搅拌器将其混匀，超声波震荡0.8-1.5h，真空抽滤，收集滤液备用。

所述的步骤2中分离的真菌接到平板PDA培养基上，25℃培养6天；于28℃，120r/min下旋转摇床上培养3天作为种子；于28℃，120r/min下旋转摇床上培养5天，终止发酵。

所述的步骤3中，将菌丝体洗涤后60℃下烘干，浸提24h，浸提3次，超声波震荡1h。

得到的沙棘内生真菌的提取物应用于促进草坪草提高抗逆性和提高产量。

与现有技术的方式相比，本发明的优点效果如下：

1、本发明从野生沙棘中分离的能提高草坪草抗旱作用的内生菌，该菌为链格孢菌，从该菌的菌丝提取物其活性来分析：由于其活性非常高，推测不是现有已知的五大类激素。而此前还没有关于从沙棘内生菌链格孢（Alternaria Sp）产生诱导草坪草提高抗旱性的物质的报道，尤其是这些活性成分可以影响根系活力，叶绿素含量，可溶性糖含量，脯氨酸含量以及丙二醛含量等生理生化指标来诱导草坪草耐旱的功能。本发明的沙棘内生真菌可与草坪草共生进化来提高植物的抗旱性，植物内生菌在与植物共生进化的过程中，形成了互惠的机制，这些机制通过对内生菌产生的活性成分的分析会逐步清楚。通过人工生产大量植物内生菌来获得有益作物生长的活性物质是一项经济有效环境友好的产业。

2、绝对用量少。本发明中菌丝提取物的使用浓度均是纳克级别的，说明该内生菌提取物活性很高，0.5ng/ml的浓度喷施草坪草，就可以诱导草坪草获得较好的耐旱性。

附图说明

图1干旱胁迫对草坪草根系活力的影响示意图。