[发明专利]一种在体内形成骨组织的细胞移植培养方法

权利要求书

1.一种在体内形成骨组织的细胞移植培养方法，其特征在于通过使用三维基质BDMatrigel材料，为成骨种子细胞在体内生长的三维结构，使得成骨种子细胞体内能够形成骨样组织结构。

2.根据权利要求1所述的在体内形成骨组织的细胞移植培养方法，其特征在于所述的三维基质结构可以稀释成不同的浓度，提供不同交联大小和强度的三维结构，根据细胞生长和分化特性进行调整。

3.根据权利要求1或2所述的在体内形成骨组织的细胞移植培养方法，其特征在于所述的三维基质结构，具有一定溶解能力的三维基质，可以在细胞移植的初期添加相应的生长因子或者小分子化合物等，在移植的细胞体内生长初期，提供适宜细胞分化和存活的微环境。

4.根据权利要求1和2所述的在体内形成骨组织的细胞移植培养方法，其特征在于所述的细胞-Matrigel复合物系统具体步骤是：

A，准备BDMatrigel形成所需的三维培养基质，

BDMartigel原液（浓度8mg/ml）,从-20°C取出后，经过4°C的过夜平衡后在冰上操作使用,按照移植细胞需要的生长条件，按照一定的比例添加所需的其它生长因子，蛋白质或者小分子化合物等；

B,准备用于移植的成骨种子细胞，

本次测试中，使用的成骨种子细胞来源于人的皮肤成纤维细胞来源的诱导性成骨细胞，该细胞适宜的培养液中主要包含9μM的CHIR99021，10μMForskolin和10nM地塞米松等化合物,准备的细胞总数是2.7x10⁶，消化细胞离心后溶解于50μl含上述物质的培养液中；

C,细胞和基质的三维复合物，

在2-8°C的冰上操作，取平衡好后的液体状50μlBDMatrigel和已经准备好的50μl细胞悬液混合，形成约100μl的液滴，滴加在细胞培养低吸附皿上,倒扣后放置于37°C培养箱中，半个小时到一个小时平衡凝固成胶状物；

根据不同细胞的生长特性，可以按照此方法调整三维基质的浓度以提供相应的结构支撑,并且添加有利于移植细胞生长的蛋白，生长因子或者小分子化合物等；

D,三维复合物的移植，

将胶状物从培养皿上剥离，直接接种于小鼠背部皮下组织,该部位缺少自身骨组织，利于检测移植细胞三维复合物的成骨性；

E，移植物的成骨性和降解性的检测，

至少4星期后，在原来的皮下移植位点取出移植复合物，进行HE染色，观察复合物的生长情况,降解效率大于80%。