[发明专利]一种产低温酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌及其基因工程菌的构建

说明书

技术领域

本发明涉及低温酸性α-淀粉酶基因克隆及基因工程菌构建，属生物技术领域。

背景技术

我国是一个农业大国，淀粉资源非常丰富，淀粉深加工是农副产品升值的重要途径。目前，几乎所有淀粉深加工的基础都是从淀粉质原料的水解开始。淀粉水解过程大多经过液化和糖化两个阶段，而现有工业用淀粉酶品种单一，国内外市场中常用的淀粉酶主要是中温和高温α-淀粉酶，其适用pH值多为6～7，在酸性条件下酶活力明显降低，不能满足淀粉原料加工工艺的要求。酸性α-淀粉酶具有在酸性环境下表现活性，使淀粉质原料可以直接进行液化糖化过程，能缩短生产周期，降低生产成本，具有很好的经济和社会效益。

在食品行业，低温α-淀粉酶作为一种安全、高效的改良剂，多用于面制品烘焙行业。如馒头生产中，将低温酸性淀粉酶添加面粉中，能明显提高酵母发酵活力，使面团发酵时间缩短。在面包制作中使用，可使面包烘焙后松软度好，色泽稳定，甜香味和口感都较理想。

自黑曲霉（Aspergillus niger）首先被发现可用于生产耐酸性α-淀粉酶后，人们相继发现多种微生物如白曲霉、青霉、酵母菌等也可产生低温酸性α-淀粉酶，但存在主要问题是大部分菌株产酶活力不高，缺乏可靠的安全性，不适宜进行工业化生产。为此，国内外研究人员进行了多方面的尝试，但到目前还未获得突破性进展，生产中使用的发酵菌株多为活性较低的曲霉。

近年来，我国烘焙行业发展较快，对低温酸性淀粉酶的需求不断增多，而目前，我国低温酸性淀粉酶生产能力滞后，表现在生产菌株单一、工艺传统、发酵产率较低，部分产品酶应用效果不理想。因此，开发低温酸性淀粉酶生产新品种，对弥补我国现有淀粉酶生产品种少、竞争力弱具有重要意义。对食品烘焙行业来讲，节约了成本、降低劳动强度、提高生产效益，具有非常好的经济效益。

发明内容

    本发明之目的是针对实际生产中存在的生产菌株老化，发酵产率低下等不足之处而提供一种产低温酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌及其基因工程菌的构建。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种产低温酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌，该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）dwsd-xm-1，该菌株于2013年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2013517。

由上述述枯草芽孢杆菌构建含低温酸性α-淀粉酶的基因工程菌的方法，是以枯草芽孢杆菌dwsd-xm-1为材料，采用生物技术手段克隆了其基因组中的低温酸性α-淀粉酶基因，构建了该基因的真核表达载体，将该载体转化至毕赤酵母中，获得高产低温酸性α-淀粉酶的基因工程菌株。具体构建步骤如下：

（1）低温酸性α-淀粉酶基因片段的获得：设计两条特异性引物SP1和SP2，序列分别为：SP1：5'CA GAA TTC ATG TTT GCA AAA CGA TTC；SP2：5'AA GCG GCC GCT CAT TGA AAG AAT GAG T。用SP1和SP2引物对枯草芽孢杆菌dwsd-xm-1中的低温酸性α-淀粉酶基因组进行PCR扩增，获得长约1452bp的基因片段，将之命名为As-Amy；

（2）低温酸性α-淀粉酶基因片段及质粒pPIC9K的酶切处理：采用EcoRⅠ和NotI限制性内切酶分别对PCR扩增得到的As-Amy基因片段和质粒pPIC9K进行酶切，然后对经酶切的As-Amy基因片段及质粒pPIC9K分别进行回收；

（3）重组表达载体pPIC9K/As-Amy的构建：将酶切回收的As-Amy基因片段和质粒pPIC9K按3：1的摩尔比混合，并添加DNA连接酶及相应缓冲液；在连接酶作用下，As-Amy基因片段和质粒pPIC9K在酶切位点粘性末端进行连接，形成重组表达载体，命名为pPIC9K/As-Amy；

（4）重组表达载体pPIC9K/As-Amy的转化：毕赤酵母GS115感受态细胞的制备、转化参照Invitrogen 公司毕赤酵母操作手册进行。

（5）阳性转化子的筛选及鉴定：将转化后的毕赤酵母涂布d在YPD平板上，分别挑取若干转化子点接至含有0.5%可溶性淀粉的MM平板上。加适量甲醇诱导，在上述平板上的部分菌落的周围出现明显的透明水解圈。