[发明专利]一类新的荧光探针及其在偶氮降解中的应用

说明书

技术领域：

本发明属于偶氮染料处理领域，具体涉及一类基于萘酰亚胺与偶氮染料通过柔性碳链相连的新的荧光探针及其在偶氮降解中的应用。

背景技术：

随着工农业生产的发展，减少持久性有机物对环境的污染及带来的危害越来越引起人们的重视。利用生物修复技术减少环境中有毒有害物质，远好于传统的物理、化学修复技术，被认为是目前最有前景的降解手段。长期以来科学家不断地从不同角度开展有机物污染物生物降解研究。一方面，筛选和驯化降解各类有机物的特殊菌种方面进行研究，另一方面，在有机物的生物降解途径机理方面开展了大量的研究工作，探知促使污染物降解的酶或酶系以及编码这些降解酶或酶系的基因，从而利用基因工程技术构建遗传工程菌。

对细菌降解过程研究，结果发现所分离纯化到的酶是决定因素，生物酶对化合物的降解速率是关键，是生物降解能力的评价标准，所以对降解酶的分离纯化和鉴定是现在研究工作的重点。但现存的问题是，虽然微生物中主要降解物—酶，比较清楚，但微生物细胞与降解物之间相互选择性还是比较模糊。微生物对被降解物分子结构选择，被降解物质分子性质和大小等因素对降解过程都有很大的影响。如果通过对被降解物在细菌降解过程的可视化分析，研究被降解物与细菌细胞作用发生的位点—细胞内质降解或者细胞外降解，荧光出现速度的不同，探讨被降解物结构性质与细菌细胞作用规律，这些研究将对生物降解的应用产生重要的影响，并为设计和开发在自然环境中易于被微生物捕获降解的化合物，从源头上降低难降解有毒性化合物对生态环境的破坏具有重要的指导意义。

偶氮染料分子结构中含有偶氮键(-N＝N-)的化合物，是一类难于生物降解的重要的生产染料，直接排放于水体中将对生态环境构成威胁、对人体健康造成危害。对于细菌偶氮还原机理的研究，尤其国内的研究，基本上处于筛选具有偶氮脱色能力的菌株和优化脱色条件的水平上，国际上的研究也仅局限在对个别偶氮还原酶的纯化和特性研究这一层面上，偶氮呼吸本质还不完全清楚，还没有建立起系统完整的厌氧偶氮还原模型，发挥作用的酶系统的特征和生理功能也没有完全阐明，对于厌氧偶氮呼吸模型的建立，还需要做进一步的研究。阐明偶氮染料在细胞内的降解过程，研究不同结构和性质的偶氮染料与微生物降解的关系，对筛选不同有机物污染物降解特定性质的菌株，提高菌株对有机污染物降解的效率都有重要的意义。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种能够应用于示踪微生物降解可视化中，标记示踪偶氮染料在细菌细胞内降解的显色过程，阐明微生物细菌细胞对偶氮染料分子的捕获和降解转移特点的荧光探针。

本发明的荧光探针，其特征在于，其结构如式1或式2所示：

探针N-Red1：

探针N-Red2：

本发明的第二个目的提供上述荧光探针在示踪检测细菌细胞降解偶氮染料中的应用。

本发明设计并合成了一类对偶氮染料的降解作用有专一选择性的荧光探针-探针N-Red1和探针N-Red2。探针N-Red1和探针N-Red2在偶氮染料未被降解时，由于分子内存在着荧光共振能量转移(FRET)，整体是无荧光的；当偶氮染料部分被细菌细胞的酶降解后，偶氮染料结构被破坏，荧光部分将会发射荧光。所设计合成的两个探针，具有不一样的性质，带磺酸基的探针(探针N-Red2)极性大，不带磺酸基的探针(探针N-Red1)极性小，通过两种探针在生物实验中的表现，揭示了微生物降解不同性质偶氮染料的不同特点。

本发明以偶氮染料为目标化合物，以偶氮染料脱色菌株为实验客体，首次将荧光探针(探针N-Red1和探针N-Red2)技术应用于示踪微生物降解可视化中，利用荧光标记示踪偶氮染料在细菌细胞内降解的显色过程，阐明微生物细菌细胞对偶氮染料分子的捕获和降解转移特点。该研究的开展将建立一套全新的基于化学荧光标记技术的微生物降解转化研究模式，更生动直观地展示微生物降解转化污染物的动力学过程，揭示化合物结构与微生物细胞捕获降解能力的相关性，为可生物降解性化合物的设计和开发提供科学理论指导，从源头减少难降解有毒污染物的产生。

附图说明

图1a是探针N-Red1与菌株随着培养时间的增长，吸收曲线强度变低与溶液颜色的变化，溶液由棕色逐渐变为黄色；图1b是探针N-Red1荧光曲线强度逐渐升高，溶液逐渐呈现黄色荧光。

图2a是探针N-Red2菌株随着培养时间的增长，吸收曲线强度变低与溶液颜色的变化，溶液由棕色逐渐变为浅黄色；图2b是探针N-Red1荧光曲线强度逐渐升高，溶液逐渐呈现黄色荧光。