[发明专利]一种抗肿瘤免疫原Z5的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤免疫原Z5的制备方法及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

目前我国肝癌患病人数逐年升高，香菇多糖作为一种具有良好生理活性的功能性因子，在肝癌患者的治疗与康复上具有重要意义。按照肿瘤病发位置的不同，肝癌分为原发性和继发性两大种，其具有长潜伏期、高度恶性、进展快、易转移、强侵袭性、起病隐匿、预后差等特点。

每年全世界新发现恶性肿瘤病人人数约为635万人，其中肝癌占到恶性肿瘤的4％即6万例，并且世界各地的肝癌发病率也在逐年上升。目前，肝癌已成为国内肿瘤死亡病因的第二位，每年约十三万患者死于肝癌。每年全世界因肝癌死亡的人数占所有因癌症死亡的人的人数的40％,致死率高。由于它是发生在代偿功能极强、体积巨大的肝脏中，说以过去一般性检查方法难以发现早期肝癌。一旦发现就常常已是中、晚期肝癌，失去了治疗的良机，所以肝癌患者的存活期往往很短。

LC是一种高度恶性的肿瘤，目前其治疗方法有中医中药治疗、西医的手术治疗、介入治疗、放射治疗、免疫治疗、基因治疗等方面。但是临床治疗效果不佳。现已形成以手术切除为主，其他非手术切除治疗措施(如：放射治疗、生物及免疫治疗、中药治疗等)为辅的治疗格局。迄今为止，对肝癌的研究仅在治疗上取得一定的成果，但是在肝癌的预防上仍是空白，目前采用的免疫治疗方法也只是应用到术后的恢复上，并没有真正的利用免疫系统从预防的角度防止肝癌的发生。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种抗肿瘤免疫原的制备方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种抗肿瘤免疫原的制备方法，该方法是在培养基中接种H22肝癌细胞同时加入香菇多糖进行共培养，培养结束后取出，反复冻融破碎细胞，离心分离后留取沉淀。

所述方法的步骤如下：

1)将对数生长期的小鼠H22肝癌细胞加入到RPMI1640培养液中，同时加入香菇多糖进行共培养，获得培养物；

2)将步骤1)所得的培养物进行反复冻融后，离心分离留取沉淀。

优选地，所述步骤1)所述小鼠H22肝癌细胞，接种数量为2～6.25×10⁷个/mL；所述RPMI1640培养液，含有10％已灭活胎牛血清，使用量为1mL；所述香菇多糖，添加量为50～175μg/mL；所述共培养，培养温度37℃，培养时间为40-56h，CO₂浓度为5％。

优选地，步骤2)所述反复冻融，是使用液氮反复冻融5次；步骤2)所述离心分离，是在4℃，4000r/min条件下离心5min。

所述方法的具体步骤如下：

1)在4mL含有10％已灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，接种对数生长期的小鼠H22肝癌细胞至细胞浓度为2～6.25×10⁷个/mL，同时加入1mL 175μg/mL的香菇多糖，在37℃，CO₂浓度为5％的条件下培养48h，培养结束后获得培养物；

2)利用液氮反复冻融步骤1)所得培养物5次后，在4℃，4000r/min条件下离心5min，弃去上清液，保留沉淀。

所述方法用于肝癌免疫预防。

本发明获得的有益效果如下：

1.利用本发明所提供的制备方法制备出的免疫原接种小鼠可以有效的延长小鼠的存活率，相对于对照组，接种本发明所制备的免疫原的小鼠存活率可提高100％。

2.利用本发明所提供的制备方法制备出的免疫原接种小鼠可以有效的保护小鼠的免疫器官，相对于对照组，接种本发明所制备的免疫原的小鼠存的胸腺指数和脾脏指数分别达到3.31、4.83。

3.利用本发明所提供的制备方法制备出的免疫原接种小鼠可以有效的提高小鼠的细胞免疫，相对于对照组，接种本发明所制备的免疫原的小鼠脾淋巴细胞增殖指数12.44(ConA)、9.39(LPS)，巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数分别达到60％、3.1。

4.利用本发明所提供的制备方法制备出的免疫原接种小鼠可以有效的提高小鼠的体液免疫，相对于对照组，接种本发明所制备的免疫原的小鼠血清抗体效价达到51200×。

附图说明

图1为实施例1-7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数(**P<0.01vs模型组，*P<0.05vs模型组)。

图2为实施例1-7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率(**P<0.01vs模型组，*P<0.05vs模型组)。

图3为实施例1免疫成功小鼠血清抗体效价(*P<0.01vs模型组)。