[发明专利]一种猪瘟病毒抗原及其猪瘟病毒胶体金检测试纸条的制备

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，更具体的说，是涉及一种猪瘟病毒E2抗原及其猪瘟病毒胶体金检测试纸条的制备。

背景技术

猪瘟是一种急性、热性、高度接触性的传染病，主要症状是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞，其高度的发病率和死亡率给世界各国的养猪业造成了巨大的经济损失。我国也是猪瘟流行较严重的国家，每年因猪瘟死亡的猪占饲养总数的3%~5%，造成了巨大的经济损失。由于它造成的经济损失惨重，所以兽医工作者一直在致力于猪瘟防制的研究。因此长期以来，猪瘟一直是疫病研究中的重点和热点。

自80年代以后，随着单克隆抗体和现代生物学技术的日益成熟和广泛应用，人们相继研制了多种猪瘟病毒（CSFV）单抗，鉴定了CSFV的中和抗原表位，尤其是测定了CSFV不同毒株的基因组全序列，从而有可能在分子水平上阐明CSFV本身的一些生物学特性以及猪瘟发生的分子机制。随着现代生物技术的发展，虽然猪瘟在其病原特性的分子生物学研究等方面已取得了很大进展，但仍有许多问题亟待解决。

在我国，由于C-株疫苗的长期使用，有效控制了猪瘟的急性发作和大流行。近年来猪瘟的发生又呈上升趋势，表现更加复杂，既有区域性大流行，又有零星散发；既有高死亡率的急性症状，又有持续感染的温和性症状。许多猪场的免疫猪群频繁发病，甚至将疫苗剂量加大数倍或数十倍，疫情依然不能控制，有些猪还因注射疫苗而引发猪瘟造成死亡，因此根除猪瘟是一项艰巨而长期的工作，对流行毒株的致病性和核酸序列进行分析研究，了解猪瘟病毒疫苗毒株与流行毒株之间的差异以及流行毒株的变异情况和致病特点，对于防制猪瘟是十分必要的。

随着基因组学的不断发展，CSFV基因组结构及其编码的蛋白已被人们进一步认识和了解。在病毒基因组所编码的蛋白中，E2是3种囊膜糖蛋白中最重要的保护性抗原，产生CSFV主要结构蛋白；而且E2基因也是猪瘟病毒中最易突变的基因，所以国内外对猪瘟的研究多集中在E2基因，E2蛋白是CSFV新型诊断抗原的首选蛋白。

本发明对国内外CSFVE2基因编码的抗原结构研究的基础上，通过已发表的不同病毒株E2基因序列进行比较，进而找出各毒株之间主要抗原结构的差异；同时通过简并引物对E2进行PCR，经杆状病毒表达系统对E2进行表达、纯化。抗原通过胶体金试纸条包被基因重组的E2对全国不同猪瘟病毒株免疫的猪血清都能进行特异、灵敏的检测，为猪瘟病毒的大批量现场检测，流行病学调查具有重要的意义；同时有效地促进猪重大疫病的监测与净化工作，对提高我国养猪业生产的整体技术水平和公共卫生安全，发挥巨大经济与社会效益。

发明内容

发明目的：为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供方便、快捷的用于检测及其猪瘟病毒胶体金检测试纸条，检测猪全血、血浆或者血清标本中猪瘟病毒抗体，用于猪瘟病的辅助治疗。

本发明的另一目的是提供上述试纸条的制备方法。

技术方案：本发明提供的一种猪瘟病毒抗体胶体金检测试纸条，其包括：同时包被猪瘟病毒E2蛋白、合成多肽及特定多肽三条带的硝酸纤维膜，含有胶体金标记的猪蓝耳病毒N蛋白的玻璃纤维膜。

其中，所述猪瘟病毒E2蛋白为在对猪瘟病毒E2基因编码的抗原结构研究的基础上，通过对已发表的不同病毒株E2基因序列进行比较，进而找出各毒株之间主要抗原结构的差异；同时通过简并引物对E2进行PCR，经杆状病毒表达系统对E2进行表达、纯化，再经杆状病毒表达载体表达制备获得。

作为优选，所述硝酸纤维膜中，猪瘟病毒E2蛋白的浓度为0.15±0.01mg/ml，合成多肽的浓度为2.0±0.1mg/ml。

作为另一种优选，所述玻璃纤维膜中，胶体标记的猪瘟病毒E2蛋白的pH值为5.0～5.4，胶体金和猪蓝耳N蛋白的配比为以36μg蛋白/ml胶体金。

作为另一种优选，还包括反应支持物（13）、免疫胶体金金标垫（12）和吸水垫（11），所述反应支持物（13）上依次相互搭接粘贴的免疫胶体金金标垫（12）、硝酸纤维膜（10）和吸水垫（11）。

作为进一步优选，所述反应支持物（13）为PVC板；吸水垫（11）为滤纸；免疫胶体金金标垫（12）为聚酯膜、玻璃纤维或滤纸纤维。

本发明还提供了上述猪瘟病毒胶体金检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

1）通过对不同病毒株E2基因序列比较，找出各毒株之间主要抗原结构的差异；