[发明专利]一种高分辨率SSR分子标记基因分型的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于测序仪的SSR分子标记基因分型的高分辨率的方法。

背景技术

生物基因组序列中存在一种由几个碱基为重复单位并经过串联排列组成的DNA序列，英文简称为SSR(simple sequence repeats)，也称为微卫星(microsatellite)(Ellegren 2004；Sharma2007)。SSR序列的特点是在品种间存在可以遗传的多态性，是本世纪以来发现的可以联系基因组序列和性状品质基因及分子育种最重要的纽带(Sharma 2007；Xu and Crouch 2008)。SSR序列是用来开发分子标记最理想的序列之一，广泛用于研究物体品种的遗传与进化关系、反向遗传中基因的图位克隆、性状的QTL定位和分子育种(Schlotterer 2004)。最早的SSR分子标记主要是从EST或者零散的DNA序列中开发。自从拟南芥和水稻基因组被测定以来，大量SSR分子标记被开发，用来定位基因，品质改良和育种(Arabidopsis Genome Initiative 2000；International Rice Genome Sequencing Project 2005；Xu and Crouch 2008)。至今SSR标记是两大广泛应用的主要分子标记之一(Davey et al.2011)。据文献查证，至今还没有报道系统的成套SSR分子标记开发和检测方法。SSR分子标记的开发报道倒是有一些。这些报道一般只适合小量的SSR标记的PCR引物设计，因为设计PCR引物的技术参数比较宽松，在应用时PCR引物往往反复需要优化每一对PCR引物的反应条件；检测往往是通过凝胶电泳的方法，从而分辨率低，劳动力大，效率低(Tong et al.2012)。Bindler等采用荧光标记和测序仪检测的办法检测SSR片段，大大提高了检测效率(Bindler et al.2011；Bindler et al.2007)；但是每一个SSR标记均需要荧光来单独标记其中的一个引物，从而增大了成本。针对现有方法的不足，我们开发了一套系统的成套SSR分子标记开发和检测方法。对于任何一个SSR分子标记，我们的方法均只要在PCR反应时加入一个通用的共同的荧光标记引物，在PCR引物设计时用软件检测了通用荧光引物与其他两个PCR引物的兼容性，从而保证了通用引物的可靠性；又由于后续PCR反应是基于共同的荧光标记引物，因此不同的分子标记的PCR条件是统一的。荧光引物合成价格比常规的引物合成要高出几倍到几十倍，因此我们的发明方法中采用通用的共同的荧光标记引物的策略，大大降低了实验成本和效率。现有一些报道一次只检测一种荧光标记的产物，我们的本发明方法可以采取多重(1‐3重)荧光产物混合检测，从而进一步提高了检测效率。

本发明的方法在反复摸索的情况下，采用全功能的Taq聚合酶，进一步保证了PCR产物长度的一致性，从而杂信号低，克服现有技术存在的基因分型的峰值不完美，峰型往往有2‐3个裂峰，跨越2‐3bp的距离，从而大大降低了分辨率的不足。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高分辨率SSR分子标记基因分型的方法。该方法能克服现有技术存在的基因分型的峰值不完美，峰型往往有2‐3个裂峰，跨越2‐3bp的距离，从而大大降低了分辨率的不足。利用本发明的方法可以达到清晰的1bp的分辨率，片段的峰型完美，没有裂峰。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，包括设计SSR分子标记的三引物，配制SSR分子标记专用的PCR配方，进行SSR分子标记专用的PCR反应，SSR分子标记的PCR产物的分析，基因分型的数据分析步骤。

如所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其中：