[发明专利]基于芽变的苹果选种的方法

说明书

一、     技术领域

本发明涉及一种苹果选种的方法，尤其是一种基于芽变的苹果选种的方法。

二、     背景技术

苹果作为一种重要的水果，被人们广泛地食用，大量的苹果都是来自芽变品种生产的，因此基于芽变的苹果选种的方法是苹果育种的一种重要方法，在现有的基于芽变的苹果选种的方法中，对疑似变异材料必须经过高接鉴定，以确定变异材料为芽变，才能剔除饰变材料，苹果选种的过程耗时长，占地多，工作量大，消耗大量的人力、财力、物力，对实验条件和人员要求高，且受自然环境影响大，选种难度大，育种效率低。

三、     发明内容

为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种基于芽变的苹果选种的方法，因此缩短了苹果选种的选育周期，提高了新苹果选种的准确性。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：其步骤是：通过SSAP分子鉴定方法对发现的疑似芽变样本确定是芽变样本、还是饰变样本，对芽变样本进行芽变资源扩繁得到品种体系，对得到的品种体系进行果实质量和经济性状评价，确定芽变样本是否为新品种。

由于设计了SSAP分子鉴定方法，通过对苹果的疑似芽变样本进行SSAP分子鉴定方法分析，直接确定是芽变样本和还是饰变样本，不再通过种植嫁接把疑似芽变样本确定是芽变样本和还是饰变样本，因此缩短了苹果选种的选育周期，提高了新苹果选种的准确性。

本发明设计了，其步骤是：

a、          初选

发掘变异：苹果园中发掘疑似芽变样本并且选好对照样本，对疑似芽变样本和对照样本进行登记编号并且作出明显区别的标记；

分析变异：通过SSAP分子鉴定方法对疑似芽变样本和对照样本进行分析，确定变异样本是芽变样本或饰变样本；

b、复选

芽变资源扩繁：把芽变样本和对照样本分别嫁接到矮化苹果砧上，再定植到选种圃中进行培育；

品系评价：对选种圃中的嫁接在矮化苹果砧上的芽变样本和对照样本的每一株进行建立档案并且分别观察，连续进行至少三年的观察记录，当嫁接在矮化苹果砧上的芽变样本和对照样本盛产果实后，至少连续三年，对果实和其它重要经济性状进行全面分析鉴定，确定芽变样本是否为最优良的品系并且定为入选品系样本，把入选品系样本在不同生态环境条件地区进行多点试验栽植，再对果实和其它重要经济性状进行全面分析鉴定。

c、           决选

根据入选品系样本的选种历史、分析鉴定结果和发展前景；即：入选品系样本在选种圃内连续三年以上果树学与农业生物学的完整鉴定数据、在不同生态条件下的试验结果和有关鉴定意见、及结对照的新鲜果实和经审查鉴定后确定该品系在生产上有发展前途，把入选品系样本进行命名。

本发明设计了，SSAP分子鉴定方法：

对疑似芽变样本和亲本对照样本采集嫩叶，提取基因组DNA，将基因组DNA进行酶切，然后加上酶切接头，再经过预扩增和选择性扩增，PCR 终产物由6％聚丙烯酰胺变性胶电泳分离，银染显色，根据条带有无差异，确定是否为芽变。

本发明设计了，所述的基因组DNA提取方法如下：

一、DNA试样的制取

a、将0.1 g的疑似芽变样本和亲本对照样本采集嫩叶分别在液氮中研碎后移入1.5 mL离心管Ⅰ中；

b、在离心管Ⅰ中加入600 μL温度为65℃的CTAB后提取缓冲液； CTAB是指2% CTAB；100 mM Tris-HCl，pH 8.0；20 mM EDTA，pH 8.0；1.4 M NaCl；使用前加入0.4% β-巯基乙醇；

c、将缓冲液放到离心管Ⅱ中，把离心管Ⅱ在65℃保温箱中保温30 min，期间颠倒几次，再加入600 μL的v/v=24/1的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒，5 min， 在转速为10000 r/min的离心机中进行离心运动10 min；

d、把离心管Ⅱ的500 μL的上清液移入到离心管Ⅲ，在离心管Ⅲ中加入加入600 μL的v/v=24/1的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒若干次，在转速为10000 r/min的离心机中进行离心运动10 min；

e、把离心管Ⅲ的300 μL的上清液移入到离心管Ⅳ，在离心管Ⅳ中加入二倍体积预冷的的无水乙醇，颠倒混匀；

f、把离心管Ⅳ中的沉淀物，放到含350 μL TE缓冲液的1.5 mL离心管Ⅴ中，当沉淀溶解后，在转速为10000 r/min的离心机中进行离心运动10 min；