[发明专利]一种从三七根际土壤提取分离化感自毒物质的方法

说明书

技术领域

本发明属于药用植物种植技术领域的方法，具体涉及一种从三七根际土壤中提取化感自毒物质的方法。

技术背景

三七[Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen]为五加科人参属植物，以根、根状茎入药，具有活血化瘀、消肿定痛等功效。目前，三七的应用已十分广泛，统计表明仅国内就有1300多家企业以三七为原料，获3207个生产批文，生产400多个产品，其中中成药品种超过了300个，几乎涵盖了所有的中药制药企业。

三七起源于2500万年前的第三纪古热带中国西南山区，分布范围仅局限于中国西南部海拔1500～1800m、23.5°N附近的狭窄地带。现已未发现野生群体，均为栽培种。云南省文山州为药材三七原产地及道地产区，是目前三七的主产区，其栽培面积和产量均占全国90％以上。2013年三七农业产值达130亿元，且市场份额还在迅猛扩大，市场对三七的需求有增无减。因此，三七是云南省目前生物资源开发最成功的品种。

与其他人参属药用植物一样，三七种植忌地性极强，存在严重的连作障碍问题。一般认为栽种过三七的地块需要连续栽种玉米、旱稻、苜蓿等作物10年以上才能再次种植三七。市场需求的驱动，加之连作障碍暂无有效克服办法导致三七传统产区的适宜土地逐渐紧张，种植区不断外延，药材生产的道地性难以保证。

现一般认为，连作障碍成因主要有：(1)土壤微生物群落的改变，病原微生物增加，有益微生物减少，土传病虫害加剧；(2)化感物质引起的自毒作用；(3)土壤盐渍化和酸渍化加重及土壤养分等理化性状的改变等(陈长宝，人参化感作用及其忌连作机制研究，博士学位论文，吉林农业大学，2006，2–9)。土壤环境灾变或恶变是三七不能连作的主要原因，当然可能与三七自身的适应能力也有关联。

然而，土壤环境灾变的驱动因素又来源于三七本身，即三七的栽种改变了土壤环境，而改变的土壤环境超越了三七本身的适应和调整能力，从而使得三七不能连作。因此，研究三七连作驱动的土壤环境变化是解析连作障碍形成机制的有效途径。目前大多数关于三七连作障碍成因的研究都是从土壤环境变化中寻找答案。而化感自毒物质是导致土壤灾变的核心原因，化感自毒物质是指某些植物通过雨雾淋溶、根系分泌及残茬降解而释放的一类对同茬或再茬同种或同科植物产生生长抑制作用的一类化合物。这些化合物虽然分子量较小，结构简单，但释放到土壤环境中后，不仅会改变植物根际土壤的理化性质，同时对根际土壤中微生物群落结构造成影响，最终导致植物生长受到抑制或直接致其死亡。因此，探索一种快速并有效提取分析三七根际土壤中化感自毒物质组成的方法对探究三七连作障碍产因，及缓解并克服三七连作障碍效应有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供的一种从三七根际土壤提取化感自毒物质，并对其提取物进行有效分离的方法。

本发明的主要内容包括：三七根际土壤的采集、土壤样品的处理、土壤样品的提取、及化感物质的分离，具体技术方案如下：

一种从三七根际土壤中提取分离化感自毒物质的方法，其特征在于：

(1)土壤样品采集：通过交叉五点法在种植三七三年的土地中进行土壤采集，取三七植株根际土壤样品；

(2)土壤样品处理：将步骤(1)所采集的土壤样品带回室内，风干，除杂，过1-2mm筛，装入自封袋中，贴上标签，待用；

(3)称取经步骤(2)处理的土壤样品20g，置于200ml甲醇中，所述甲醇为分析纯，超声处理30min；用滤纸过滤，收集滤液，所收集的滤液即为提取得到的化感自毒物质提取液；于4℃保存，待测；

(4)将步骤(3)所保存的滤液用高效液相色谱法进行分离，色谱条件为：色谱仪为Agilent 1260，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18、250mm×4.6mm、5μm，流动相A为质量分数为0.1％的H₃PO₄水溶液，流动相B为甲醇,所述甲醇为色谱纯，流速1.0ml/min，柱温25℃，检测波长203nm，并按如下表1所述梯度洗脱参数进行梯度洗脱，分离得到的单个色谱峰对应的物质即代表具有化感自毒效应的单个化合物，

表1梯度洗脱参数表