[发明专利]快速鉴定西瓜新品种红和平杂交种子纯度的方法以及采用的引物和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及快速检测西瓜新品种‘红和平’杂交种子纯度的方法以及采用的引物和试剂盒。

背景技术

西瓜新品种【Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai】是一种重要的经济作物。我国每年西瓜新品种种植面积约为1.73×10⁶hm²，总产量约为6.28×10⁷t，面积和产量分别占世界的54％和60％以上，均居世界第一位。因此，西瓜新品种种子纯度对种植者来说是必需保证的。

西瓜新品种杂交种制种的过程中，母本和父本分别种植在不同的区域，雌花开花前，把母本上所有的雄花都去除。开花期用父本的花粉授到母本的雌花柱头上，从而产生杂交种。如果母本上的雄花去除不彻底，花粉就可能落到雌花柱头上产生自交种，出现杂种。因此，杂交种必需进行种子纯度鉴定。

传统的西瓜新品种种子纯度鉴定主要是通过将杂交种种植后对其进行形态学鉴定。西瓜新品种的全生育期需要80～100天，漫长的生长周期易受环境影响。某些易受环境影响的性状就会难以判定，所以需要对其品种特性极其了解的专业育种者。这些都使得鉴定过程受到了极大的限定。为了解决传统鉴定困难的问题，农业工作者进行了研究，其中黄永红等采用同工酶的方法检测西甜瓜种子纯度，张国良采用叶形进行鉴定。但前者仍需要15-20天的时间，后者不能鉴别叶形相同的亲本且对种植环境要求苛刻。

随着分子标记的快速发展，将分子标记应用到其中将加速种子纯度的鉴定过程，而且鉴定过程不需要特定的育种家。分子标记对种子纯度的鉴定主要是依据父母本及杂交一代中的遗传信息存在多样性，因此鉴定过程包括分子标记所需引物的开发，DNA的提取，筛选等等。西瓜新品种基因组测序的完成，为采用分子标记进行种子纯度鉴定提供了可能。发明基于SSR分子标记技术的种子纯度检测方法，将对规范西瓜新品种种子产业，保护育种者的合法权益及种植户的切身利益等都有重要的意义。

发明内容

本发明针对目前西瓜新品种种子纯度鉴定大多靠田间表型观察的方法、存在受季节限制大，鉴定所需时间长等缺陷，本发明的第一个目的是提供了一种不依赖季节、快速、准确、低成本检测西瓜新品种“红和平”种子纯度的方法。本发明的第二个目的是提供了上述方法采用的引物。本发明的第三个目的是提供了上述方法采用的试剂盒。

为了实现上述第一个目的，本发明采用的技术方案如下：

西瓜新品种‘红和平’种子纯度的鉴定方法，该方法包括以下步骤：

1)西瓜新品种基因组SSR引物的开发：根据公布的西瓜新品种基因组序列进行全序列的下载，使用Mreps 2.5SSR序列鉴定程序，鉴定DNA序列上含SSR的序列区段，设计出跨越SSR位点的PCR引物；

2)单粒西瓜新品种种仁基因组DNA提取：采用SDS法提取西瓜新品种种仁基因组DNA；对提取的DNA样品进行评估；

3)PCR反应体系及程序：在200μl PCR管中加入基因组DNA50ng、10pmol/μl引物各1μl，该引物由上游引物和下游引物，所述的上游引物的序列为5＇-CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3＇和下游引物5＇-GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3＇，12.5μl混合液，混合液包括10×Buffer、dNTP、Mg²⁺、TaqDNA聚合酶，灭菌双蒸水补充到25μl，同时设置空白对照实验，空白对照实验以无菌水代替基因组DNA；混匀后置于PCR反应仪上进行扩增，PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共40个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存；

4)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，在扩增产物中加入上样缓冲液，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯酰胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚蓝刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后再可见光下观察、照相；将PHF/PHR引物的亲本和F1电泳图绘制成标准图谱；

5)待测样品种子纯度鉴定利用PHF/PHR引物，将待测样品种子按上述步骤制备出指纹图谱后，再分别与‘红和平’品种标准图谱进行比对；如果相同，即可确定为‘红和平’杂交种，否则为杂种；种子纯度按以下公式计算：

种子纯度＝(检测所得真种子数/检测种子总数)×100％。