[发明专利]一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因工程技术领域，具体涉及一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法。

背景技术

粮食安全和生态安全是我国农业持续发展中的首要问题。水稻为保证我国粮食安全做出了巨大贡献。但水稻生产消耗了大量的淡水资源，作为重要的粮食作物，其用水量占到农业用水总量的很大一部分，因此我国很多地区缺水的现状已成为影响水稻产量的重要原因之一。我国大约有一亿多亩盐碱地，主要分布在东北、华北、西北等干旱和半干旱地区以及长江以北的沿海地区。随着我国人口的剧增及工业的高速发展，可耕地急剧下降，而不合理灌溉、耕作等又造成了大量良田的次生盐渍化，特别是受侧渗补给的低洼地，土壤盐渍化日益严重，且有逐年增加的趋势，严重威胁着我国的水稻生产。除了干旱、盐碱等非生物胁迫外，稻田杂草因与水稻争夺光、水、肥等资也成为影响水稻产量和品质的重要因子。杂草竞争干扰导致水稻减产15％以上。杂草籽粒掺杂，影响谷物品质，有毒杂草还危害人类健康。一些杂草是作物病虫害的重要寄主，间接增加了田间杀虫剂等化学物质的投放。

因此，抗逆和抗除草剂水稻新品种培育迫在眉睫。但是传统育种周期长，选育过程复杂，而且很难获得兼具抗逆和抗除草剂的能力的新品种。为了克服盐碱和干旱等非生物逆境对农业生产的危害，满足世界和我国对抗旱、耐盐水稻品种日益增长的需求，同时有效地控制稻田杂草，降低劳动力需求，提高水稻增产潜力，本申请应用现代生物技术，克隆了小立碗藓中的抗逆基因8981基因，与抗除草剂基因bar共同构建表达载体后，通过农杆菌侵染法导入适于旱地种植的栽培稻即旱稻栽培种中，创制一批重要的转基因新材料，为培育抗逆、高产、优质的新品种提供重要的基础，该技术目前还未见有相关的报道。

发明内容

针对现有技术存在的技术缺陷，本发明的目的在于提供一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法，包括以下步骤：

1)利用抗逆8981基因构建重组表达载体pCAMBIA3301-Ubi-8981；

2)将重组表达载体转化入农杆菌，并利用农杆菌菌液侵染目的旱稻的胚性愈伤组织，利用共培养基培养；

3)对共培养后的愈伤组织脱菌并恢复，转移至含有草铵膦的筛选培养基中进行筛选；

4)将筛选的抗性愈伤组织经预分化和分化培养，将分化形成的再生小苗转入生根培养基中培养，幼苗生根后炼苗、移栽，得到抗逆、抗除草剂的转基因旱稻。

本发明所述的8981基因序列为SEQ ID NO.1。

所述的重组表达载体的构建方法为：用EcoR I和BamH I酶切Ubi-T载体，得到含有Ubiquitin基因的片段；用BamH I和Pml I酶切8981-T载体，得到含有8981基因的片段；将含有Ubiquitin和8981基因的片段依次插入到载体pCAMBIA3301的多克隆位点中，得到所述重组表达载体命名为pCAMBIA3301-Ubi-8981。

进一步的，所述的Ubi-T载体为：通过将Ubiquitin基因连接pG EM-T vector得到，所述的Ubiquitinp基因PCR扩增引物为5’-CGG AATTCCTGCAGTGCAGCGTGACC-3’和5’-CGGGATCC CTGCAG AAGTAACACCAAACAAC-3’，扩增出的Ubiquitin长度为2.0kb。

进一步的，所述的所述8981-T载体为：将8981基因连接pGEM-T vector得到，所述的8981基因PCR扩增引物为5’-GGATCC TC TTGTGTATATTGTGCGC-3’和5’-CACGTG TGCGGTGTCTTATT TACTAT-3’。

本发明所述目的旱稻为鲲旱1号。

所述的共培养基为：NB+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+葡萄糖10g/L+AS20mg/L+凝胶3.2g/L，培养条件为：pH5.2，25℃暗培养3天。

所述的愈伤组织恢复培养基为：NB+特美汀500mg/L+麦芽糖30g/L+凝胶0.58％，pH6.0，培养条件为：28℃暗培养7天。

所述的筛选培养基为：NB+麦芽糖30g/L+特美汀300mg/L+草铵膦40mg/L+凝胶3.2g/L，pH6.0，28℃避光筛选三轮，40天。