[发明专利]重组人透明质酸酶及其制备方法和采用聚乙二醇共价修饰的化合物和方法

权利要求书

1.一种制备重组人透明质酸酶聚乙二醇修饰化合物的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）重组人透明质酸酶基因的获得是通过全基因合成和通过设计引物，再 PCR 获得，表达载体pPICZa A，宿主菌为毕赤酵母P.pastoris SMDll68H，酶切位点是 Xho I/Xba I，用Zeocin做抗性筛选，培养基培养的温度控制在30℃，诱导表达为每隔24h补加终浓度为0.5%（v/v）的甲醇作为诱导剂，诱导96小时，层析技术是离子交换层析、疏水层析和分子筛层析；

2）根据文献Genebank NM153189报道的人透明质酸酶cDNA序列，经过碱基优化,将模板基因中的稀有密码子同义替换P.pastoris的偏爱密码子，并去除富含AT区，以此为模板设计引物，上游引物：5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’，下游引物：5’- GGCAAATGGCATTCTGACA-3’，并在上下游引物分别引入限制性内切酶酶切位点Xho I、Xba I；使用该对引物扩增人透明质酸酶基因，对扩增获得的人透明质酸酶片段进行Xho I和Xba I双酶切，连接至具有相对应切口的表达载体上，载体pPICZa A经Xho I和Xba I双酶切，转化至E.coil TOP10中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒pPICZa A-ph20， 经DNA测序比对，重组序列正确；重组质粒经Sac I线性化后电转入表达宿主P.pastoris SMDll68H中，用Zeocin做抗性筛选，得到工程菌，重组克隆子经PCR验证正确；

接种阳性克隆进行培养，每隔24h补加终浓度为0.5%（v/v）的甲醇作为诱导剂，诱导96小时，取出发酵液，通过离心收集上清，DNS法测定酶活性，并进一步分离纯化；

3）将收集到的破菌上清液用离子交换层析法分离纯化，其过程为用pH值为6.0 的20mmol/L磷酸盐缓冲液稀释，使其电导率小于5mS/cm；用同样的缓冲液平衡 SP-Sepharose Fast Flow柱，上样后用平衡缓冲液洗至基线，用0.01～0.5mol/L的NaCL梯度洗脱，收集目标蛋白峰；

4）目标蛋白补加(NH₄)₂SO₄使终浓度为1.0-1.5mol/L，样品上用1.2mol/L (NH₄)₂SO₄，20mmol/L PB，pH值6.0的缓冲液平衡的Phenyl-Sepharose Fast Flow柱，通过降低盐浓度梯度洗脱，收集目标蛋白峰；

5）得到的疏水层析峰经Sephadex G-25脱盐，平衡液为20mmol/L PB，pH值6.0；样品脱盐后即为精细纯化的人透明质酸酶；

6）纯化的毕赤酵母表达人透明质酸酶纯度大于95％，浓度2.0mg/ml，用G-25柱交换缓冲液，配制平衡缓冲液0.1mol/L Na₂PO₄，20mmol/L NaCl，流速10ml/min，待柱流出液达到平衡后上样，收集蛋白峰；将分子量5kd的单甲氧基PEG丙酸酯按质量比10∶1加入到改变缓冲体系的透明质酸酶中，室温搅拌修饰2小时后终止反应；用pH值为6.0的20mmol/L磷酸盐缓冲液稀释，使其电导率小于5mS/cm；用同样的缓冲液平衡SP-Sepharose Fast Flow柱，上样后用平衡缓冲液洗至基线，用0.01～0.5mol/L的NaCl梯度洗脱，收集目标蛋白峰。