[发明专利]一种增强型CIK细胞制剂及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于免疫细胞体外培养领域，尤其是涉及一种免疫增强型CIK细胞制剂及其制备方法。

背景技术：

目前，随着肿瘤学、免疫学以及细胞分子生物学等相关学科的迅速发展和交叉渗透，各种形式的肿瘤免疫治疗方法正逐渐由试验走向临床应用，而过继性免疫治疗是目前较为常用的一种肿瘤免疫治疗方式，成为现代肿瘤治疗中继手术、放疗、化疗后的第四大治疗模式。过继性免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy，ACI)是通过在体外大量分选扩增高活性的免疫效应细胞，并将其输给患者以增强患者细胞免疫功能的一种行之有效的肿瘤治疗方式。此类免疫细胞的种类包括了细胞因子诱导的杀伤性T细胞(CIK)、肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)、特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或经转基因技术改造后的T淋巴细胞(例如CAR-T细胞)等。在众多的免疫细胞中，CIK细胞因其兼具T淋巴细胞强大的杀瘤活性和非MHC限制性杀瘤特征，在临床上得以广泛应用。

CIK细胞能通过体外诱导而得以扩增，常规的CIK制备方法是将分离的外周血单个核细胞(PBMC)用IFN-γ预处理24h后，加入CD3mAb，IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的CIK细胞，但最终获得的CIK细胞的增殖倍数和细胞毒活性都不很理想。近年来以此为基础，一些研究人员也尝试使用一些可以刺激细胞生长的细胞因子如IL-12、IL-15、IL-7、IL-24、SCF、FLT3L等，但这些因子的使用多数仅在一定程度上促进细胞的增殖，对细胞毒活性的提高不够理想，尤其在CIK细胞中主要效应细胞是表达CD3⁺CD56⁺表面分子的NKT样细胞，兼具有T淋巴细胞和NK细胞的双重特性，因此探索建立能同时提高这两类细胞效应分子的细胞培养体系是十分必要的。

发明内容：

本发明提供一种新型免疫增强型CIK细胞制剂，具有增殖能力强、杀瘤谱广、杀瘤活性强、非MHC限制性，对多重耐药肿瘤细胞敏感等其它一些效应细胞无法比拟的优点。所述CIK细胞为经由外周血单个核细胞(PBMC)扩增培养成的由细胞因子诱导的杀伤细胞。本发明解决的技术问题是常规CIK扩增方法所得到的CIK细胞增殖倍数和细胞毒活性不够理想的问题，并针对这些问题提供了一种新的用于扩增CIK的方法。

本发明提供了一种高效扩增并具有高细胞毒性的免疫增强型CIK细胞制剂及其制备方法，该CIK细胞制剂对细胞毒活性效果的维持更为稳定，同时满足了对细胞高增殖能力的要求，有利于临床应用效果的提高。本发明还进一步提供了一种用于体外培养CIK的细胞制剂。

与常规仅单纯向培养体系中添加多种促进细胞生长的细胞因子的CIK细胞培养方法相比较，本发明CIK细胞制剂及其制备方法具有诸多特点。

在本发明的一个实施方案中，将抗CD3/抗CD226的双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)同时包被，其中CD3单克隆抗体起到丝裂原活性作用，可通过与T细胞表面CD3分子交联，诱导其活化；作为NK细胞活化受体的CD226主要表达于活化T细胞和NK细胞表面，参与人混合淋巴细胞反应中杀伤性T细胞、NK细胞的活化聚集，引起NK细胞和T细胞表面活化分子CD69的表达升高，细胞因子(IFN-γ)与颗粒酶B(Granzyme B)的表达都明显升高，可以显著提高CIK细胞中NK样T细胞的杀伤活性。

在CIK细胞培养过程中，常规加入IFN-γ刺激，PBMC会发生凋亡，影响了细胞的扩增。因此在本发明的另一个实施方案中，选用具有更强刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节的I型干扰素：重组人干扰素-α2α和重组人干扰素-α2β；PHA具有高效的促进免疫细胞增殖的作用，作为T细胞的强刺激剂，促进免疫活性细胞前体向免疫活性细胞转化，有效提高CIK细胞尤其CD3⁺CD56⁺细胞的增殖倍数。

在本发明的优选实施方案中，将抗CD3/抗CD226的双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)同时包被，同时在CIK细胞培养过程中，使用重组人干扰素-α2α和重组人干扰素-α2β以及PHA。

一方面，本发明提供一种免疫增强型CIK细胞的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：配包被液：离心管中加入生理盐水，向其中加入Retronectin、抗CD3及抗CD226单抗；

步骤二：CIK细胞诱导培养的方法步骤如下：