[发明专利]一种分离纯化的无细胞百白破-b型流感嗜血杆菌-A群C群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种联合疫苗，其特征在于，它由A组分和B组分组成：

所述A组分为液体制剂，它由以下组分组成：

百日咳毒素：5～40μg；丝状血凝素：5～40μg；百日咳黏附素：2～10μg；白喉类毒素：10～25LF；破伤风类毒素：4～10LF；氢氧化铝：1.0～2.0mg/ml；氯化钠：7.5～9.5g/L；

    所述B组分为冻干制剂，它由以下组分组成：

    A群脑膜炎多糖结合物：10～30μg；C群脑膜炎多糖结合物：10～30μg；B型流感嗜血杆菌多糖结合物：10～30μg；乳糖：5～20mg。

2.如权利要求1所述的一种联合疫苗的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

S1. 制备各单价疫苗原液：包括白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液、无细胞百日咳疫苗原液，所述无细胞百日咳疫苗原液包括百日咳毒素、丝状血凝素和百日咳黏附素；

S2. 制备液体制剂：将百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳黏附素、白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液加入用氯化钠稀释的氢氧化铝佐剂内，调pH至5.8～7.2，即为无细胞百白破疫苗半成品；

S3. 制备各单价疫苗原液：包括A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液；

S4. 制备冻干制剂：将A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按照1:1:1（w/w）合并混匀，加入乳糖，用注射用水稀释，即为AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品；

S5. 分装和包装

将上述制备的吸附无细胞百白破联合疫苗半成品分装于西林瓶或者预灌装注射器中，AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品分装于西林瓶中进行真空冷冻干燥后再独立包装。

3.如权利要求2所述的一种联合疫苗，其特征在于，A组分由以下步骤制备而成：

S1. 制备各单价疫苗原液

S11. 白喉类毒素原液：开启白喉杆菌，先在产毒培养基种子管中传1～3代，再转至产毒培养基制成生产用种子；采用培养罐液体培养，培养基采用改良林氏培养基，34～36℃培养45～52h，培养结束后加入甲醛杀菌，在培养物中加入硫酸铵沉淀杂蛋白，离心收集上清；上清液超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白，离心收集沉淀，加生理盐水溶解，超滤去除毒素中的硫酸铵，加入甲醛，置35～37℃，脱毒30天，除菌过滤即为白喉类毒素原液；

S12. 破伤风类毒素原液：开启破伤风梭状芽孢杆菌，先在产毒培养基种子管中传1～3代，再转至产毒培养基制成生产用种子；采用培养罐液体培养，培养基采用双胨培养基，34～36℃培养62～72小时；培养结束后加入甲醛杀菌，培养液经过滤去除菌体，加入硫酸铵沉淀毒素蛋白，离心收集沉淀，超滤去除毒素中的硫酸铵后加入甲醛，置35～37℃脱毒30天，除菌过滤即为破伤风类毒素原液；

S13.无细胞百日咳疫苗原液：开启百日咳杆菌，接种于改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基，于35～37℃培养不超过48小时，再接种于CPB培养基中传两代，每代培养时间18～26小时，进行扩增培养以制备足够的生产用种子，然后接种到发酵罐中液体培养，培养基采用CPB培养基，37℃培养两天，培养结束后在培养物中加入0.01%硫柳汞进行杀菌处理，将收获的培养物离心，离心收获的菌体和上清液2～8℃保存待下一步纯化；

百日咳黏附素的分离纯化：将菌体采用60℃热释放，超滤浓缩后，上样于Capto adhere层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，收集含百日咳黏附素的洗脱组份，再上样于Capto SP层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，以氯化钠梯度洗脱，收集洗脱峰，即为分离纯化的百日咳黏附素；

百日咳毒素和丝状血凝素的纯化：将上清液超滤浓缩后上样于Capto SP层析柱，流动相采用含尿素的磷酸盐缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，分别收集含百日咳毒素和丝状血凝素的洗脱组份，将含百日咳毒素的洗脱组份上样于CaptoMMC层析柱，缓冲液采用Tris-HCl缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，收集百日咳毒素洗脱峰；将含丝状血凝素的洗脱峰上样于羟基磷灰石层析柱纯化，收集洗脱峰；

制备无细胞百日咳原液：将百日咳毒素采用戊二醛、丝状血凝素和百日咳黏附素采用甲醛进行脱毒，除菌过滤后即为无细胞百日咳原液；

S2. 合并及稀释：将百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳黏附素、白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液加入用氯化钠稀释的氢氧化铝佐剂内，调pH至5.8～7.2，即为无细胞百白破疫苗半成品。