[发明专利]免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平间接Elisa检测试剂盒及其检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平间接Elisa检测试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是迄今为止发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。PCV2是一种DNA病毒，目前关于PCV2的致病机制还不清楚。及时快速的诊断对有效控制疫病具有重要意义。抗体是分析PCV2致病机制和建立相应的诊断方法的最基本物质材料，免疫兔血清是最常见的一种类型抗体，通过重组抗原检测免疫兔血清抗体的有效性，对充分保障抗体乃至在此基础上建立的其它检测方法的可靠性具有重要意义。

PCV2病毒粒子直径14－17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA。基因组全长为1768bp或1767bp，毒株间的核苷酸序列同源性大于96％。基因组有两个主要的开放阅读框(open reading frame,ORF)，即ORF1和ORF2。ORF1编码病毒的复制酶，与病毒的复制转录有关。ORF2编码病毒的结构蛋白即衣壳蛋白Cap，可以与PCV2的抗血清反应。所以，Cap重组蛋白常常用于抗体的诊断和检测。

目前检测PCV2抗体水平的方法主要是酶联免疫吸附分析方法(enzyme-linked immunoadsorbent assay,ELISA)，该方法由于简便、快速、灵敏、特异等优点逐渐取代传统的琼脂扩散法。兔子是制备免疫血清的主要动物之一，通过反复免疫可以产生高效价的抗体，这些抗血清经过纯化以及进一步的标记后，可以用于ELISA、免疫组化、流式细胞术以及激光共聚焦等免疫学分析。所以，首先建立起能够充分评价免疫兔血清的ELISA方法具有重要意义。

发明内容

本发明提供了免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平间接Elisa检测试剂盒，能够很好的检测免疫兔血清中的抗体水平，为此，本发明还提供其检测方法和应用。

本发明提供免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平间接Elisa检测试剂盒，所述试剂盒以PCV2病毒基因组开发阅读框ORF2编码的重组蛋白为包被抗原。

优选地，所述重组蛋白的氨基酸序列参见SEQ ID No.2。

进一步地，所述重组蛋白的制备方法为：将PCV2的Cap编码基因克隆至pET30a(+)表达载体的多克隆位点处，获得重组表达质粒，将重组质粒转入宿主感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组表达菌株，在IPTG诱导下，表达PCV2-rCap，经过镍柱亲和层析，获得了纯化的PCV2-rCap。

优选地，所述试剂盒包括一抗抗体稀释液，所述一抗抗体稀释液为：含有2％pET30a-E.Coli菌体裂解液,5％脱脂奶粉和5％BSA的PBST。所述百分比为质量体积比。

优选地，所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为山羊抗兔二抗，所述酶为辣根过氧化物酶。

进一步地，所述酶标二抗的稀释度为1:2000。

优选地，所述试剂盒中包被抗原的包被浓度为：100ng/100μL。

本发明的第二个目的是提供免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平的间接Elisa检测方法，步骤如下：

(1)包被酶标板：将纯化后的PCV2-rCap-pET30a重组蛋白和pET30a-E.Coli菌体蛋白分别包被微孔板，洗涤；

(2)封闭酶标板，洗涤；所述封闭剂优选含有5％脱脂奶粉的PBST；

(3)加入稀释后的兔血清一抗，洗涤；稀释兔血清一抗所用的稀释液优选为含有2％pET30a-E.Coli菌体裂解液,5％脱脂奶粉和5％BSA的PBST；所述百分比为质量体积比；

(4)加入稀释后的酶标二抗，37℃恒温箱温育1小时，洗涤；稀释酶标二抗所用的稀释液优选含有5％脱脂奶粉的PBST稀释液；选择此浓度的稀释液效果最佳。

(5)显色，终止并在酶标仪上读取OD_490nm的光吸收值。

优选地，所述重组蛋白的纯化方法为：采用镍柱亲和层析法纯化所述重组蛋白，具体为：先用包涵体洗涤液洗涤重组蛋白包涵体，离心保留沉淀后再用尿素洗涤，然后用bufferB溶解包涵体沉淀，离心收集上清液，将上清液加入平衡后的镍柱，室温结合；之后先后用Buffer C和Buffer D洗柱子，收集组分，最后用Buffer E洗柱子收集组分。