[发明专利]明亮发光杆菌冻干粉及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及明亮发光杆菌制剂及其制备方法。

背景技术

基于现阶段我国环境污染状况，发光菌毒性检测法是高效便捷的测定污染物生物毒性的有效手段。发光菌毒性检测法的最大优势是它可以现场检测，方法快速、准确，操作简便。发光细菌的相对发光度和水体综合毒性呈显著负相关，利用光电检测技术将对环境敏感的发光细菌用于水体毒性的检测具有简单、快速的优点。在现场进行毒性检测，要求操作快速、简单，而新鲜菌液不方便携带，在户外也不易保存。因而更多的是使用冻干粉，只需5分钟的快速复苏后即可使用，活性与灵敏度与新鲜菌液接近。然而，市场上销售的冻干粉价格贵，而且难以保证每批活性在同一水平。因此，许多科研机构开始自主研制冻干粉，既能保证菌的稳定活性也能降低经费。而制备冻干粉的关键在于冻干前的菌悬液制备，其中保护剂成分及配比影响最显著。本研究拟通过优化后的菌液制备冻干粉，克服传统检测方法范围小、结果不稳定等缺点，使得发光菌生物毒性检测范围更广、结果重复性和准确性更高，为进一步拓宽发光菌在线监测的实际应用打下基础。

发光杆菌属菌体多呈杆形，革兰氏阴性菌，无孢子和荚膜，有鞭毛。最适生长温度一般为15-26℃，最适pH范围一般为6.5～7.5，超过25℃生长_.将受到抑制，其_.生长_.基质里需要一定的NaCl，起到维持渗透压的作用。

目前，所述明亮发光杆菌是采用如下的方法保存的：

取一支发光细菌冻干粉，用砂轮将安瓿瓶切开一个小口，在超净工作台内，缓慢加入1ml冷藏过的3％NaCl，轻微震荡，复苏10min后，用接种环接种至固体培养基中，20℃下生长20～24小时，直置黑暗处可见蓝绿色光。用接种环挑取一个较亮的单菌落，置于50ml的液体培养基中，20℃振荡培养18～20小时。

菌种保存：将菌液离心，除去上清液，重新悬浮于含有3％NaCl的灭菌甘油里(20％甘油)，分装置EP管中，于-70℃保存。此保存方法保存时间较短，仅用于保存菌种，无法直接进行毒性测试。

微生物在进行冻干是一种较好的方法，一般需要有冷冻保护介质(例如简单的10％脱脂乳或是较复杂的动物血清)帮助菌体在低温下存活。优质的冷冻保护剂至少具备两种功能：当细胞里的水分逐渐流失时，保护剂可以稳定细胞形态；维持干燥前后的样品形状。

目前，常用的冻干保护剂有二糖，如海藻糖、BSA血清，脱脂乳，甘露醇等，但是，单一的保护剂，难以获得较好的效果，需要进行改进。

保护剂的主要作用是在冷冻过程中，消除细胞内部冻结水之间的冰晶机械作用，因为机械作用会破会细胞内部的化学键、细胞质膜。但由于各个保护剂的浓度、细胞渗透的能力等等不尽相同，因而所起的冷冻保护作用会有差异。

发明内容

本发明的目的是提供一种明亮发光杆菌冻干粉及其制备方法，以克服现有技术存在的缺陷。

本发明所述的明亮发光杆菌冻干粉，包括如下重量百分比的组分：

优选的：包括如下重量百分比的组分：

脱脂乳29～31％

海藻糖21～23％

精氨酸0.8～0.9％

氯化钠1.1～1.4％

菌体余量

最优选的：包括如下重量百分比的组分：

脱脂乳30.0％

海藻糖22.1％

精氨酸0.9％

氯化钠1.3％

菌体余量

1、糖类中，双糖冷冻保护剂效果最为显著，而其中，海藻糖则是双糖中冷冻保护效果最为突出的糖类。

与其它糖类相比，海藻糖的抗冷冻脱水能力更强。与蔗糖、果糖等双糖相比，海藻糖的水化体积通常要大二至三倍，在大分子溶液中排阻作用比一般的糖强，海藻糖的水溶液可以将生物分子包封在一个外形更加坚固的结构中。

与海藻糖相比，蔗糖更实惠，但是其冷冻保护能力远不及海藻糖。因此在冷冻干燥过程中一般优先考虑海藻糖作为保护剂。

2、氨基酸是一种常见的作用类似于蛋白质类的冷冻保护剂。其中L-精氨酸是氨基酸中常用的冻干保护剂之一。有文献报道，血小板在冷存时，加入L-精氨酸可起到很好的抗冻保护作用；培养基里添加一定量的精氨酸，对具有发光能力的生物的荧光素酶的合成有着重要作用。