[发明专利]高效表达腺病毒的细胞、及制备腺病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及高效表达腺病毒的细胞、及制备腺病毒的方法。

背景技术

腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳呈规则的20面体结构。腺病毒家族(Adenoviridae)的成员可感染种类相当广泛的有丝分裂后细胞，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，脑细胞和心脏细胞。因为腺病毒可将自身的基因组递送到细胞核中，宿主范围广、可感染分裂和非分裂细胞、外源基因装载容量大等优点，所以腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者，已广泛地被应用于基础研究和临床试验中。

病毒载体作为新一代的转基因载体，在生物医药产业各环节都有广泛的应用前景，具体表现在：

(1)病毒载体是研究基因功能的必备工具。

(2)病毒载体是基因靶向治疗的利器。

(3)病毒载体是药物研发和筛选方案实施的强有力助力器。

虽然有着广阔的应用前景，但由于其技术难度大，成本高，时空表达难以有效控制等特点，使得病毒载体技术在生命科学领域的应用受到一定阻力。

目前根据需要已经开发三代腺病毒载体：E1区或者E1&E3缺失的载体被称作第一代腺病毒载体；E2区或者E2&E4缺失的载体被称作第二代腺病毒载体；依赖于辅助病毒的腺病毒载体(Helper-Dependent Ad，HD-Ad)通常也称作无偿腺病毒或者高容量载体被划分为第三代腺病毒载体。

目前已有的腺病毒载体系统有三种：

1、经典的双质粒共转染法(同源重组)

原理是同源重组。在腺病毒左臂区域(通常缺失E1基因区)插入目的基因表达盒构成腺病毒穿梭质粒，与带有腺病毒全基因组(通常缺失E1基因区)的大质粒共同转染携带E1基因区的细胞如293细胞，两种质粒在293细胞内通过同源重组形成重组腺病毒基因组，并包装成病毒颗粒。主要缺点是重组效率比较低。

2、AdEasyTM包装系统

AdEasyTM包装系统主要的特点是利用原核重组酶在大肠杆菌中完成外源基因插入腺病毒基因组的过程，获得环状的重组腺病毒基因组，并且具有在细菌中复制的必需元件。将重组腺病毒基因组酶切线性化后转染293细胞，避免了双质粒共转染得到重组腺病毒难度大的风险。由于获得重组腺病毒质粒有明显的筛选方法，操作步骤也比较好掌握，因此这个系统一出现就受到极大的欢迎。

3、AdMax包装系统

AdMax包装系统是通过Cre/loxP获得重组病毒，与目前使用最普及的AdEasy系统相比，有一定的优势：AdMax系统只需要2～4周就能完成从质粒构建到重组出毒，因在真核细胞内重组出毒，保持了对腺病毒的生存压力，有助于重组腺病毒的基因组的完整性；而AdEasy系统的出毒成功率只有18-34％，且在原核细胞(BJ5183)中完成病毒基因组重组，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会受到影响。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种安全高效制备腺病毒的技术。

本发明的第一方面，提供了一种分离的细胞或细胞系，所述细胞高表达ABCB4基因。

进一步地，所述“高表达”是指与野生型的细胞相比，高表达ABCB4基因的细胞中ABCB4基因表达水平至少高出30％，较佳地高出50％，最佳地高出100％。

进一步地，所述细胞是包含外源的ABCB4基因的细胞。优选地，所述细胞：(a)具有含有ABCB4基因的载体；或者(b)基因组中整合有外源的ABCB4基因。

进一步地，所述细胞中还包含腺病毒载体。

优选地，所述细胞或细胞系为293A细胞或细胞系。

进一步地，所述含有ABCB4基因的载体以pHBLV-CMVIE-IRES-puro质粒为骨架。

进一步地，所述腺病毒载体为pHBAd-U6-GFP质粒。

优选的，所述ABCB4基因的序列如SEQ ID NO.:1所示。

本发明的第二方面，提供了一种高效制备腺病毒的方法，包括步骤：

(1)制备高表达ABCB4基因的细胞；

(2)用高表达ABCB4的细胞扩增腺病毒。

进一步地，步骤(1)中所述细胞为293A细胞。