[发明专利]一种三重RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种三重RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

猪传染性胃肠炎病毒（PEDV）感染的主要症状为呕吐、带严重恶臭的水样腹泻，体重下降及严重脱水。5周龄以上猪死亡率较低，在成年猪上发病温和，可能出现食欲不振、腹泻，哺乳母猪可能出现无乳。但2周龄以下的仔猪最易感染，且发病率与死亡率较高，可能由饥饿，脱水和酸中毒引发死亡。本试剂盒适用于对猪流行性腹泻病毒的辅助诊断。

猪流行性腹泻病毒（TGEV）感染的主要症状为水样腹泻，或者进食后呕吐；病猪体温正常或稍高，精神沉郁，食欲减退或废绝；断奶猪、母猪常呈精神萎顿、厌食和持续性腹泻大约一周，并逐渐恢复正常，少数猪恢复后生长发育不良；肥育猪在同圈饲养感染后都发生腹泻，一周后康复，死亡率1%--3%。

猪A群轮状病毒（GAR）感染的主要症状为急性腹泻，仔猪多发，主要表现为精神委顿、厌食、呕吐、腹泻、脱水、体重减轻等临诊症状。成年猪与育成猪多为隐性感染，是引起猪胃肠炎的常见病因。本病最早于1943年在患腹泻的儿童中发现，1975年首次从猪中分离出轮状病毒，目前本病呈世界性流行，轮状病毒病是一种人畜共患传染病，能侵害人类和许多畜禽，不仅感染率高，发病率也相当高，对人类健康和畜牧业危害较大。

目前，用于检测PEDV、TGEV和GAR的常用方法有病毒分离、荧光抗体检测、免疫组织化学法、电镜、ELISA病原检测法和RT-PCR等。但是，病毒分离耗时耗力且比较困难；荧光抗体检测和免疫组织化学法非特异性较高且需要荧光显微镜进行观察；ELISA病原检测方法应用比较广泛，但相较PCR方法过程较为复杂；常规RT-PCR每次只能检测一种病原且需要将RNA反转录后再次进行PCR，操作繁琐，容易造成气溶胶污染。

因此本发明设计一种一步法三重RT-PCR检测试剂盒，简化操作步骤，只通过一步PCR就能确定单一感染或混合感染，并能确诊感染病毒种类。该试剂盒具有操作简便、准确、快速等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种三重RT-PCR检测试剂盒，能够快速、准确的做出检测。

本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：一种三重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒由用于病毒RNA提取的A盒和用于RT-PCR检测的B盒构成，A盒内设有缓冲液RG 9 mL、缓冲液RF 3 mL、缓冲液RD 8 mL、缓冲液RW 12 mL、RNA洗脱液3 mL、50倍TAE电泳缓冲液8 mL、染色液10μL、上样缓冲液30μL、Rnase-free吸附柱、收集管10个、离心管10个和0.2 mL PCR管10个，B盒内设有扩增反应液220μL、酶系10μL；所述扩增反应液中包括用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒的PCR 引物组，所述引物组由三组引物序列组成，用于猪流行性腹泻病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；用于猪传染性胃肠炎病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；用于猪A群轮状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

所述三重RT-PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

步骤一、模板RNA的提取

①、在已处理的样品中加入800μL缓冲液RG，充分颠倒混匀后在室温下静置5min，制得混合液Ⅰ，备用；

②、向混合液Ⅰ中加入200μL缓冲液RF，混匀后在温度为30℃下孵育10min，之后放入温度为2-8℃，转速为12000rpm的离心机中离心15min，收集上清液，向上清液中加入500μL缓冲液RD，并在温度为15-30℃下孵育5min，制得混合液Ⅱ，备用；

③、将混合液Ⅱ转入套有收集管的Rnase-free吸附柱中，室温下静置2min后，放入转速为12000rpm的离心机中离心1min，弃去收集管中液体，再向Rnase-free吸附柱中加入800μL的缓冲液RW，室温下静置2min后，放入转速为12000rpm的离心机中离心1min，弃去收集管中液体，然后在转速为12000rpm的离心机中离心2min，以除去残留的洗涤液，备用；

④、将步骤③处理后的Rnase-free吸附柱放入离心管中，向吸附膜中央处滴加50μL RNA洗脱液，室温下静置2min后，放入转速为12000rpm的离心机中离心1min，收集上清液即得模板RNA；

步骤二、PCR扩增