[发明专利]快速鉴定南瓜实蝇的SS-PCR特异性引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检疫性害虫检测领域，快速鉴定南瓜实蝇的SS-PCR特异性引物及试剂盒。

背景技术

南瓜实蝇Bactrocera(Zeugodacus)tau(Walker)是一种入侵重大检疫性害虫，属双翅目Diptera实蝇科Tephritidae果实蝇属Bactrocera果实蝇亚属Bactrocera。南瓜实蝇是农业上的重要害虫，现今在日本、越南、老挝、柬埔寨、泰国、马来西亚、菲律宾、印度尼西亚、不丹、印度、斯里兰卡以及中国等国家均有分布。在进出境的果蔬中经常截获各种不同的实蝇的幼虫、卵或蛹，甚至为头、胸、翅、足等残体，对于幼虫的分类鉴定要比成虫要困难得多，为了保证鉴定的准确性通常是将幼虫在室内饲养为成虫，而这需要花费较长的时间，严重影响了水果进出口贸易的通关速度；而对于残体则是无法对其进行正确的识别。

近年来，以研究基因结构和功能为主的现代分子生物学和以DNA重组技术为核心的生物技术研究取得了突飞猛进的发展，预示着分子生物技术将成为21世纪的新兴重点学科。分子生物学技术主要针对于形态特征极其相似的近缘种、复合种及种以下的亚种、生物型、地理种群的识别和鉴定，能解决传统的形态学分类方法难以解决的问题。因此，迫切需要发展有关于实蝇的快速鉴定识别的技术。

种特异引物PCR(Species-specific PCR，SS-PCR)技术是与通用引物PCR(universal-primers PCR，UR-PCR)技术相区别而提出来的，两种技术的原理相似，只是种特异引物PCR技术在根据靶序列设计引物时，要充分考虑引物的特异性，能够在扩增未知模版时，通过检测目标片段的有无就能把目标种和其它种鉴别开来。

对于卵或头、胸、翅、足等残体的检测，样本中仅存微粒靶标DNA，因此，需要设计的种特异引物具有极高的灵敏性；同时，样本中可能混有近源物种，因此要求设计的种特异引物具有加强的特异性。现有技术虽然提供了根据已知序列设计扩增引物的软件，但不能解决如何兼具灵敏性和特异性的问题。

发明内容

本发明的目的是提供快速鉴定南瓜实蝇的SS-PCR特异性引物。

本发明的再一目的是提供快速鉴定南瓜实蝇的试剂盒。

本发明的再一目的是提供快速鉴定南瓜实蝇的方法。

根据本发明的快速鉴定南瓜实蝇的SS-PCR特异性引物包括：

NF404：5’TGCCTTAGCGATATTCTGGCT3’；

NR610：5’AACTGTGTTCAGCAGGTGGT3’。

上述引物对扩增得到的鉴定南瓜实蝇的特异性片段的序列为：

5’-AGGATGAACAGTTTACCCACCCCTATCGTCTATTATTGCTCATGGAGGAGCATCAGTTGATTTAGCAATTTTTTCTTTACACCTAGCAGGAATCTCATCTATTTTAGGGGCTGTAAATTTTATTACTACAGTCATTAATATACGATCAACAGGAATTACTTTCGATCGAATACCTTTATTTGTTTGAGCCGTTGTATTAACTGCCCTCCTTTTATTACTTTC-3’

本发明提供了一种采用特异性引物快速鉴定南瓜实蝇的方法，能够准确及时对截获的疑似南瓜实蝇的卵、蛹、幼虫、成虫及残体等进行鉴定，建立了一种快速鉴定南瓜实蝇的方法。

根据本发明的具体实施方式，通过种特异引物PCR(SS-PCR)和琼脂糖凝胶电泳技术，筛选出了1对南瓜实蝇的特异性引物，引物序列为：NF404：TGCCTTAGCGATATTCTGGCT；NR610：AACTGTGTTCAGCAGGTGGT。选用番石榴实蝇、桔小实蝇、颜带实蝇、锈实蝇、瘤胫实蝇、杨桃实蝇、瓜实蝇、辣椒实蝇、具条实蝇、近黑颜实蝇、黑膝实蝇、滇寡鬃实蝇、何氏华实蝇、枣实蝇、瓜棍腹实蝇、腿端黑实蝇、黑颜实蝇等作为阴性对照来证明本发明设计的引物的特异性，大大缩短了南瓜实蝇的鉴定周期。

本发明具体提供了一种采用特异性引物快速鉴定南瓜实蝇的方法，具体方法如下：