[发明专利]一种利用实时荧光PCR检测偏肺病毒的方法和组合物

权利要求书

1.一种检测受试者是否携带偏肺病毒的方法，包括如下步骤：

利用Trizol法提取受试样品的RNA，逆转录样本RNA至cDNA和利用实时定量PCR检测受试样品是否携带偏肺病毒；

其中，相对于对照样品中实时荧光PCR的测定结果，受试样品测定结果如果能计算出Ct值或检测曲线呈S型，即表明受试者携带有偏肺病毒。

2.根据权利要求1所述的一种检测受试者是否携带偏肺病毒的方法，所述利用Trizol法提取受试样品的RNA，逆转录样本RNA至cDNA和利用实时定量PCR检测受试样品是否携带偏肺病毒具体步骤包括：利用生理盐水清洗两次咽试子并收集细胞，并利用Trizol试剂裂解细胞；然后按照200ul/1mlTrizol的比例利用氯仿去蛋白，吸出的上清中再等体积加入异丙醇沉淀RNA，最后用75％的乙醇以1ml75％乙醇/1mlTrizol的比例清洗RNA；处理的RNA可保存在75％乙醇溶液中并贮存与‐70℃或直接进行逆转录步骤。

3.根据权利要求1所述的一种检测受试者是否携带偏肺病毒的方法，所述逆转录提取的样本RNA至cDNA，是使用了Invitrogen的M‐MLV逆转录试剂盒。

4.根据权利要求1‐3中任一权利要求所述的一种检测受试者是否携带偏肺病毒的方法，其中，偏肺病毒融合基因(F)的特异性探针/检测引物作为诊断组合物，用于测定从受试者中所提取的咽试子的逆转录产物。

5.根据权利要求4所述的一种检测受试者是否携带偏肺病毒的 方法，其中所述的诊断组合物用于测定从受试者中所提取的咽试子的逆转录产物，包括通过结合实时定量PCR，判断受试样品中是否含有偏肺病毒；相对于对照样品中的实时定量PCR结果，受试样品中的实时定量PCR的结果如果能计算出Ct值或检测曲线呈S型，即表明受试者携带有偏肺病毒。

6.根据权利要求5所述的一种检测受试者是否携带偏肺病毒的方法，所述的对照样品包括有阳性对照样品以及阴性对照样品；阳性对照样品来自于阳性对照组；阴性对照样品来自于阴性对照组。

7.根据权利要求6所述的一种检测受试者是否携带偏肺病毒的方法，阳性对照样品来自于预先诊断为携带偏肺病毒患者咽试子提取物的逆转录cDNA或偏肺病毒阳性患者的咽试子；阴性对照样品来自于未被诊断携带偏肺病毒患者的咽试子或其咽试子提取物的逆转录cDNA，以及DEPC水、生理盐水；

等浓度添加偏肺病毒诊断组合物的引物hMPV‐For1、hMPV‐Rev1、hMPV‐For2a、hMPV‐For2b、hMPV‐Rev2至实时定量PCR的检测体系中；

在20μl检测体系中，每个引物的终浓度为0.9μM；同时，检测所用的通用探针在检测体系中的终浓度为0.2μM；另外，在20μl体系中加入5μl cDNA溶液，余下体积需用ddH₂0补足；

实时荧光PCR检测的程序设置为60℃30s，接着95℃10min，随后95℃15s，60℃1min进行45个循环，最后60℃30s；

从获自受试者的咽试子样品中，利用Trizol法提取RNA，然后 逆转录RNA至cDNA；通过利用偏肺病毒的诊断组合物并结合实时定量PCR的方法对cDNA进行检测，并比对受试样品与对照样品的检测结果。受试样品的检测结果若与阳性样品的检测结果类似，即受试样品测定结果如果能计算出Ct值或检测曲线呈S型，则表明受试者携带有偏肺病毒。

8.一种用于检测偏肺病毒的诊断组合物，其中所述诊断组合物包含有用于检测偏肺病毒融合基因(F)的特异性引物/探针；其中A亚型为一组上、下引物；B亚型为两组引物，包含有两个上游引物hMPV‐For2a、hMPV‐For2b，一个下游引物hMPV‐Rev。

9.根据权利要求8所述的一种用于检测偏肺病毒的诊断组合物，其中所述探针为通用探针，其中所述探针为通用探针，可用于平行检测偏肺病毒的A与B两种亚型；其中使用的通用探针的5’端荧光报告基因可选择FAM、HEX、TET；在进行检测的时候，将A亚型和B亚型的引物按相同的比例混合加入实时荧光PCR的扩增体系中，并同时加入通用探针，即可同时检测出偏肺病毒的两种亚型。

10.根据权利要求9所述的一种用于检测偏肺病毒的诊断组合物，其中：

5’荧光基因为FAM，3’端淬灭基因为MGB。