[发明专利]一种适用于淡水红藻DNA的提取方法

权利要求书

1.一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取淡水红藻藻体100-150mg置于研钵中，向研钵中加入适量液氮，将淡水红藻藻体研磨成粉末；

2)将研磨好的淡水红藻藻体粉末置于第一个2.0ml的离心管中，并向离心管中加入1ml的多糖溶解缓冲液，充分混匀后将离心管置于55℃的水浴或金属浴中加热1h，在浴热过程中间隔颠倒混匀；

3)将浴热混匀后的淡水红藻藻体冷却至常温，在5000rpm的转速下离心处理3min，弃上清，收集沉淀物；

4)向步骤3)收集的沉淀物中依次加入800μl 55℃预热的DNA提取缓冲液、2μlβ-巯基乙醇和6-8μl浓度为20mg/L的蛋白酶K，充分混匀后置于55℃的水浴或金属浴中加热1h，浴热过程中每10min颠倒混匀一次；

5)向步骤4)制备的混合液中加入800μl的水饱和酚，温和混匀5min，在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第二个2.0ml的离心管中；

6)向步骤5)制备的上清液中加入与上清液相同体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第三个2.0ml的离心管中；

7)向步骤6)制备的上清液中加入与上清液相同体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第四个2.0ml的离心管中；

8)向步骤7)制备的上清液中加入与上清液相同体积的氯仿和异戊醇的混合物，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第五个2.0ml的离心管中；

9)向步骤8)制备的上清液中加入-20℃预冷的无水乙醇和pH为5.2浓度为3mol/L的醋酸钠，其中无水乙醇与上清液的体积比为2:1，醋酸钠与上清液的体积比为1:10，轻摇混匀并在-20℃的温度下冷冻30min或在常温下静置直至絮状物出现，并于室温下在10000rpm的转速下离心处理20min，弃上清，收集沉淀物；

10)向步骤9)收集的沉淀物中加入1ml浓度为75％温度为40℃预热的乙醇，轻摇洗涤沉淀，并于室温下在10000rpm的转速下离心处理5min，弃上清，收集沉淀物；

11)在室温下将步骤10)收集的沉淀物置于通风处挥发乙醇，待沉淀物透明后，向透明溶液中加入50μl的超纯水或TE溶液，并在4℃的温度下静置1h后即得淡水红藻DNA。

2.根据权利要求1所述的一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤2)中使用的多糖溶解缓冲液为浓度为0.5-1mol/L的葡萄糖溶液。

3.根据权利要求1所述的一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤4)中使用的DNA提取缓冲液为浓度为0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷碱溶液、pH为8.0浓度为0.05mol/L的乙二胺四乙酸二钠水溶液、浓度为0.5mol/L的氯化钠水溶液或质量分数为1％的十二烷基硫酸钠水溶液中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，其特征在于：所述淡水红藻藻体为用硅胶干燥后的冷冻淡水红藻藻体。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，其特征在于，所述的淡水红藻为串珠藻属或熊野属。