[发明专利]一种三维细胞培养平台、其制备方法及其使用方法

权利要求书

1.一种三维细胞培养平台，其特征在于，包括：成骨支架，聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球，胰岛素；所述成骨支架为网状结构，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球附着于所述成骨支架上，所述胰岛素包裹于所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球中，基于所三维细胞培养平台的总质量，所述胰岛素的质量分数为0.5‰～5‰，优选为0.5‰～3‰，更优选为0.5‰～1‰。

2.如权利要求1所述的三维细胞培养平台，其特征在于，所述成骨支架的孔隙率为80％～85％，孔径大小为100～200μm。

3.如权利要求1所述的三维细胞培养平台，其特征在于，基于所述三维细胞培养平台的总质量，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的质量分数为0.5％～5％，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的粒径1～5μm。

4.一种制备如权利要求1所述的三维细胞培养平台的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球

将胰岛素和琥珀酰明胶溶解于pH值为1.5～3的乙酸水溶液中作为第一水相W1，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于二氯甲烷溶剂中作为油相O，将聚乙烯醇和氯化钠溶解于水中第二水相W2；其中，琥珀酰明胶和胰岛素的质量比为1：(3～8)；胰岛素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1：(5～15)；

将第一水相W1和油相O进行初乳化，制成W1/O型初乳液；将W1/O型初乳液与第二水相W2进行复乳化，制成W1/O/W2型乳液；

将制得的W1/O/W2型乳液稀释于水中，通过离心得到含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球；

(2)制备成骨支架

将质量比为1：(1.5～3)的牛腱胶原和羟基磷灰石分别溶解于乙酸中，制成牛腱胶原乙酸溶液和羟基磷灰石乙酸溶液；在0～5℃的条件下，将羟基磷灰石乙酸水溶液加入到牛腱胶原乙酸水溶液中，得到混合溶液，并调节混合溶液的pH值为7.2±0.2；加入戊二醛水溶液，搅拌均匀后真空脱气，然后在-20～-30℃的条件下静置15～30小时以形成成骨支架，最后将成骨支架真空干燥；

(3)制备三维细胞培养平台

将含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球分散于中性磷酸盐缓冲溶液中，然后向其中加入成骨支架，所述含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球与成骨支架的质量比为1：(10～20)，采用负压抽吸法将含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球吸入成骨支架的网状结构，干燥，得到三维细胞培养平台。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，用于溶解牛腱胶原和羟基磷灰石的乙酸水溶液的pH值为2～5。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一水相W1中，胰岛素的浓度为1：(10～20)mg/mL；所述第二水相W2中聚乙烯醇和氯化钠的浓度分别为(5～15)mg/mL和(5～15)mg/mL。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，初乳化时，乳化线速度为20～40m/s，乳化时间为30～100s；复乳化的乳化的线速度为0.6～1.5m/s，乳化时间为30～100s。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球质量与磷酸盐缓冲溶液的体积比为：(2～8)：1mg/mL。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，得到三维细胞培养平台后，将其按要求大小或骨缺损形状进行切割，经过钴60辐照灭菌后，得到无菌的三维细胞培养平台。

10.如权利要求1所述的三维细胞培养平台的使用方法，其特征在于，包括：

将骨髓间充质干细胞重悬以10⁷/cm³接种于三维细胞培养平台；

将接种了骨髓间充质干细胞的三维细胞培养平台整体放入培养瓶中，加入L-DMEM培养基+5％胎牛血清，37°，5％CO₂；骨髓间充质细胞1～4小时后完成贴壁；体外培养1～3天后细胞即可长至70％；在无菌操作条件下，将包含骨髓间充质干细胞的三维细胞培养平台直接置入骨缺损区，无张力缝合。