[发明专利]羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法

权利要求书

1.羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：材料的处理：

唾液、乳汁样品的处理方法：

12000～16000r/min离心5～10min后，取200μL上清，加入800μL Virus holder 溶液，反复冻融3次，0.22µm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；

内脏样品处理方法：

取0.5g样品，用无菌PBS洗2～3次，剪碎后加入1mL Virus holder 溶液用匀浆器研磨至匀浆状，反复冻融3次，3000～5000r/min离心5～10min后取上清，0.22µm滤膜过滤，滤液-20℃保存备用；

步骤二：病毒分离：

取1mL滤液接种于已铺满培养瓶瓶底80%～90%的牛睾丸原代细胞，37℃，5%CO₂培养箱孵育1～1.5h后弃去毒液；

加5～10mL细胞维持液，37℃，5%CO₂培养72h后收毒；

反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，从第2代开始接毒600uL，在第3代接种牛睾丸细胞后的72h可观察到细胞病变；

步骤一中，Virus holder 溶液包含Tris 0.01 mol/L、NaCl 0.15 mol/L和EDTA 0.005 mol/L；

Virus holder 溶液的配置方法为：

先称取Tris放入洗净的烧杯中，再称取NaCl 放入烧杯中，然后加入EDTA，再加入500 mL双蒸水，搅拌至完全溶解，调整pH到8.0，配好的溶液用0.22µm滤膜过滤后，4℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法，其特征在于：

步骤二中，牛睾丸原代细胞的培养液为含有5%犊牛血清的M199培养基，牛睾丸原代细胞在该培养基中37℃、5%CO₂培养2～3天待用。

3.根据权利要求2所述的羊口疮病毒低含量样品的病毒分离方法，其特征在于：

步骤二中，细胞维持液为含有2%犊牛血清的M199培养基。