[发明专利]抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv及其应用

说明书

本发明提供了抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C‑scFv，它是利用人工合成的重组蛋白BontB，及筛选抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C‑scFv的底物GFP‑HIS6‑SNAP25（62）‑VAMP（57）‑C，人源化抗B型肉毒毒素酶抗体库中筛选出来的，亲和常数为（4.38±0.445）×10⁵L/mol，为生产抗B型肉毒毒素特效救治药物及快速检测B型肉毒毒素奠定了基础。

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv，及其应用，在生产治疗B型肉毒毒素酶中毒药物方面、检测B型肉毒毒素酶方面的应用。

背景技术

肉毒毒素可导致人及动物肉毒中毒，其感染剂量极低，从灵长类动物实验中得出，最低致死剂量（LD50）为1ng/kg，因此，它已被美国疾病控制和预防中心指定为对人类的威胁类似于炭疽的生物武器。导致肉毒中毒的原因大致分为四个类型，一、成人肉毒中毒。二、婴儿感染性肉毒中毒。三、伤口感染性肉毒中毒。

肉毒毒素是肉毒梭菌在自然状态下或者是在培养基中形成，通过细菌裂解释放到环境或培养液中，这种形态的毒素被称为前体毒素，其分子量范围在300 kDa到900 kDa。前体毒素通常以复合体的形式存在，由神经毒素（Bont），由一个或多个能够包围和保护毒素的非毒性蛋白组成，包括血凝素（HA）,非毒素非血凝素（NTNH）。临床上所说的肉毒毒素通常指具有神经毒性作用的神经毒素部分。

肉毒毒素根据其抗原性的不同，共存在七种血清型（A、B、C、D、E、F、G、），尽管七种血清型的肉毒毒素组成成分与它的作用机制略有差别，但是它们有着相近的分子量和相似结构。成熟肉毒毒素均由约150 kDa的单链多肽组成，蛋白质成熟时通过细菌介导的蛋白酶将150kDa的单链多肽切割裂解成两个不相等的多肽片段，两个片段由一个二硫键连接，形成一个分子量为50kDa的轻链片段（LC）和一个分子量为100kDa的重链片段（HC）。其中轻链有一个催化功能域，重链包含分子量均为50kDa的两个功能域， N端部分为跨膜域，C端部分为神经节苷脂结合域。单独的轻链和重链均无毒性，只有双链才具有生物学毒性。

轻链由细胞内毒素蛋白组成，具有锌离子依赖内切酶活性，可抑制神经递质的释放。肉毒毒素的活性区埋藏（~20 Å深）于轻链中，表面负电荷，可通过一个通道获得。梭状神经毒素的活性位点包括一个单一的锌原子，这个锌原子历来被认为有功能，但是不起结构性作用。可以通过用金属螯合剂去除锌，但是通过在二级结构上加入游离的锌原子来重新获得锌，毒素与底物结合的能力几乎不变，但轻链的生物学活性却大大的降低了，只相当于原来的30%。位于轻链中心有一个高度保守的锌结合模块HExxH （X是任意的氨基酸）序列。HExxH 序列中含有一个由3个组氨酸整合的锌离子，并对突触泡膜蛋白质具有特异性蛋白水解活性，这个催化位点位于蛋白质表面较深的裂缝中。

在人类肉毒中毒中，A型肉毒毒素和B型肉毒毒素占据最重要的地位，其中A型肉毒毒素轻链上的His 222, Glu223 和His226残基共同组成了锌结合模块HExxH 序列的一部分，并且在协调活性区锌（His 222 和His226）和一个水分子（Glu223残基）的作用机制中起了直接的作用。Glu261 是协调锌的第三配体。甚至有人认为A型肉毒毒素的催化机理与嗜热菌蛋白酶是相似的，这是因为基于结构和序列相似的基础上，他们的活性位点也是相似的。从Glu223到 Asp的突变使得活性几乎全部失去，去除His226使A型肉毒毒素失去了催化活性。通过对肉毒毒素结构分析表明，A 、B型肉毒毒素中与作用机制相关的关键氨基酸残基是相同的。与突触泡蛋白结合的B型肉毒毒素的晶体结构表明，Arg369 和 Tyr372残基位于接近被毒素裂解的肽键。肉毒毒素中中和残基的突变使催化速度常数明显降低，但是不影响锌结合和底物结合，人们提出，这些残基在过渡态稳定中发挥了作用。

另外，在LC活性中心还有一些氨基酸残基，如Phe266、Glu350Arg363和Tyr366。它们的功能主要是维持和稳定轻链活性中心的结构和/或它与被结合底物的相对位置，以此保证轻链最佳的酶解能力。