[发明专利]鉴别PRV强毒和PRV gG、PRV gE基因缺失疫苗毒的PCR引物

说明书

技术领域

本发明属于动物疫病检疫检测技术领域，具体的，涉及鉴别PRV强毒和PRV gG基因缺失疫苗毒、PRV gE基因缺失疫苗毒的PCR引物。

背景技术

伪狂犬(Pseudorabies，PR)是世界范围内广泛发生的一种猪的急性、高度接触性传染病。该病传染性强，易继发细菌和其他病毒的混合感染或继发感染，主要以新生仔猪的急性死亡及4周龄以上仔猪出现神经症状，妊娠母猪以繁殖障碍、流产、死胎及呼吸道症状为特征。近年来，尤其是2012年，PR在我国相继发生，在23个以上省内流行，出现高发病率和死亡率，新生及4周龄以内的仔猪突然发病，死亡率可高达100％等新的发病特点。该病无特效药物治疗，成为危害养猪业的主要疫病之一。

PR病原为伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)，属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科水痘病毒属的猪疱疹病毒I型，基因组全长为150kbp。目前已在PRV中发现了11种糖蛋白，分别命名为gB、gC、gD、gE、gG、gH、gJ、gK、gL、gM和gN。其中gD基因编码的gD蛋白与gI蛋白形成复合体，参与病毒的吸附过程，是重要的免疫原性蛋白。gG基因是PRV中的一个分泌性的非必需糖蛋白基因。gE基因编码的gE蛋白是一种促进细胞融合的糖蛋白，介导病毒从细胞到细胞之间的扩散。影响PRV在猪体内的组织趋向性，是经三叉神经节侵入中枢神经组织所必需的。

目前，国内外使用最广的PRV基因缺失疫苗是gE基因缺失疫苗。美国使用gE、gG和gC基因缺失疫苗。但在日本多使用gG基因缺失疫苗，我国生产的以鄂A株为亲本毒株构建的T K^-/gG^-/LacZ⁺基因缺失疫苗高安全性，免疫效果优于国外同类产品，在国内也广泛应用。

现已有的PRV诊断方法主要是针对全病毒抗体或gE抗体缺失的血清学ELISA诊断方法，这些方法存在操作繁琐、技术要求和试验条件要求高、试验周期长等缺点，难以满足快速、大量鉴别检测的需要，目前PCR检测方法针对PRV的单一基因的判断，无法满足快速鉴别检测PRV强毒和PRV gG和PRV gE基因缺失疫苗毒的需要。因此建立一种快速、高效、特异、敏感的检测方法，从而能同时对PRV强毒、PRV gG和PRV gE基因缺失疫苗毒进行快速鉴别检测，对于PR的快速确诊具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可快速鉴别检测PRV强毒、PRV gG基因缺失疫苗毒以及PRV gE基因缺失疫苗毒的三重PCR检测引物。

本发明的另一目的是提供上述引物在PCR鉴别PRV强毒和PRV gG、PRV gE基因缺失疫苗毒中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的发明人经大量比对GenBank中PRV gD、gG、gE基因序列，选取PRV gD、gG、gE基因高度保守且具有型特异性基因的序列为模板，设计合成PRV gD、gG、gE基因特异性引物对，分别命名为PRV gD-F(P1)、PRV gD-R(P2)、PRV gG-F(P3)、PRV gG-R(P4)、PRV gE-F(P5)和PRV gE-R(P6)；由此，提供了一种鉴别PRV强毒和PRV gG基因缺失疫苗毒、PRV gE基因缺失疫苗毒的PCR引物，具体的：

P1：3’-GGAGGACGAG CTGGG GCTGC-5’(SEQ ID NO：1所示序列)；

P2：3’-CCACGCCCCG CTTGA AGCTG-5’(SEQ ID NO：2所示序列)；

P3：3’-ACACCCGCAC GCGCATCGAC-5’(SEQ ID NO：3所示序列)；

P4：3’-TCTCGGCGGC GGTCACGTTC-5’(SEQ ID NO：4所示序列)；

P5：3’-GTCACCGAGG TCCCGAGTCC(SEQ ID NO：5所示序列)；

P6：3’-GCGTGTAGAG GCCCGTGTCG(SEQ ID NO：6所示序列)。

其中，P1和P2用于扩增PRV gD片段，片段长度为212bp。

P3和P4用于扩增PRV gG片段，片段长度为315bp。

P5和P6用于扩增PRV gE片段，片段长度为472bp。

本发明还提供含有上述引物用于鉴别PRV强毒和PRV gG、PRV gE基因缺失疫苗毒的试剂盒。